熒光及可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增試劑盒
產(chǎn)品名稱： 熒光及可視化 RT-LAMP 擴(kuò)增試劑盒
英文名稱： Fluorescent and Colorimetric RT-LAMP Kitv
產(chǎn)品編號： Z00603
產(chǎn)品價(jià)格： 0
產(chǎn)品產(chǎn)地： 中國
品牌商標(biāo)： 雅吉生物
更新時間： null
使用范圍： null
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1.?含可見光和熒光染料，既可以用金屬浴和水浴擴(kuò)增用可見光肉眼判斷結(jié)果，也可用熒光?PCR?儀進(jìn)行實(shí)時熒光檢測。
2.?內(nèi)含的?dUTP-UNG?可防交叉污染。
3.?特異性比?RT-PCR?高，因?yàn)?/font>?RT-LAMP?擴(kuò)增使用?4-6?條引物而不是兩條。
4.?靈敏性可達(dá)?10?拷貝/反應(yīng)以下（隨引物而不同），故假陰性率更低。
只可用于科研，只可進(jìn)行定性檢測，不能用于定量檢測。
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成 份 |
編號 |
塑料盒包裝 |
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MMLV?逆轉(zhuǎn)錄酶（含?RI），200U/μL |
60905a |
50?μL（黃蓋） |
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4×RT?Buffer（含?dNTP） |
60905b |
250?μL（白蓋） |
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5×熒光及可視化LAMP?MagicMix |
200603a |
200?μL（綠蓋） |
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Bst?DNA?聚合酶?2.0（8U/uL） |
200403 |
50?uL?(紅蓋) |
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RT-LAMP?陽性對照模板-引物混合物 |
130923a |
20?μL（黃蓋） |
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超純水 |
100935 |
1mL（亮黃蓋） |
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使用手冊 |
200603sc |
1 份 |
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低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年
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RT-LAMP?模板及?RT-LAMP?引物、PCR?級石蠟油（僅對使用金屬浴或水浴者）。
準(zhǔn)備工作：如果使用水浴鍋或金屬浴，需要在實(shí)驗(yàn)啟動前打開并調(diào)到?60-65℃。如果用金屬浴，還必須在孔中加水以填充金屬孔和反應(yīng)管間的空隙。金屬浴和水浴溫控遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如PCR 儀器，所以使用前需要用陽性對照和陰性對照（水）做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)可用。一、樣品 RNA 的制備
1.?用自選方法純化樣品的?RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)?RNA?提取試劑盒兼容。
2.?如果有?N?個樣品，則至少需要做?N+2?個樣品制備，包括一個制備陽性對照（制備時加入自備的跟要檢測的靶分子相同的陽性對照模板，一起經(jīng)歷提取過程）和一個制備陰性對照（用水替代樣品）。最后?N+2?個樣品一起進(jìn)行?RNA?提取操作，得到?N+2?個?RNA?樣品。
二、合成?1st-strand cDNA
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按下表配制?RT?反應(yīng)體系:
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成分 |
加入量 |
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自備?RNA?模板總?RNA 或?poly(A)?mRNA 或?qū)Ｒ坏?RNA 注意：RNA?樣品不能有基因組?DNA?污染。 |
? 100-500?ng 10-500?ng 0.01pg-500ng |
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自備引物 F3 |
1?μL |
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4×RT?Buffer（含?dNTP） |
5?μL |
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自備?RNase-free?水 |
補(bǔ)水到?19?μL |
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4.?70℃保溫?5?分鐘后立即冰浴。
5.?37℃保溫?5?分鐘。對富含二級結(jié)構(gòu)的高?GC?RNA?模板，可改成?45℃保溫?5?分鐘。
6.?加入?1μL?(=200?U)?MMLV?逆轉(zhuǎn)錄酶（含?RI），終體積為?20μL。
7.?42℃保溫?60?分鐘。
8.?70℃保溫?10?分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的?cDNA?可以直接作為
LAMP?模板使用，不需要純化。
三、?熒光及可視化?LAMP 擴(kuò)增及檢測（20μL 體系）
9.?反應(yīng)設(shè)置：如果有?N+2?個?cDNA?樣品，則最好設(shè)置?N+4?個LAMP?擴(kuò)增，增加?LAMP
陰性對照和?LAMP?陽性對照各?1?個。在?N+4?個?0.2mL?PCR?管中加入下列成分：
10.?混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。由于本產(chǎn)品含雙染料，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇下列三種方式進(jìn)行擴(kuò)增和檢測。
11.?如果使用PCR?儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測，則必須先在每個反應(yīng)管中加?30?μL?自備的石蠟油，否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會蒸發(fā)，影響反應(yīng)效率（如果使用?PCR?儀器并開啟熱蓋，則可以不加石蠟油）。60-65℃保溫?90?分鐘，肉眼觀察管內(nèi)液體顏色。
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12。如果使用熒光定量?PCR?儀：設(shè)為?60-65℃保溫?1?分鐘/循環(huán)，?90?個循環(huán)，每分
鐘在?FAM?通道采集一次熒光信號。
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13.?如果使用PCR?儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，再使用?qPCR?儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)：?則在擴(kuò)增前和擴(kuò)增后，分別在?qPCR?儀器上測熒光讀數(shù)（溫度設(shè)為?60-65℃，1?次循環(huán)，每次循環(huán)?1?分鐘，在?FAM?通道采集一次熒光信號。注意：測熒光讀數(shù)必須在?65℃進(jìn)行）。擴(kuò)增反應(yīng)按?60-65℃，90?分鐘進(jìn)行。
四、?結(jié)果分析及解讀
14.?如果是用普通PCR?儀器、水浴或金屬浴進(jìn)行的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié)果。將反應(yīng)管放置在白色背景（如白紙）TUNEology 波長可調(diào)檢測卡盒-->