細胞特性

1） 來源：人

2） 形態：上皮細胞樣，貼壁生長

3） 含量：>1x10^6  細胞數

4） 規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

運輸和保存

干冰運輸及復蘇好存活細胞

（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。

（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。

細胞接收后的處理

1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。

2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。

3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完全培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。

4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完全培養基來培養細胞。  收到細胞后第一次傳代建議T25培養瓶1：2傳代 。

一．培養基及培養凍存條件準備

1）準備MEGM kit培養基 （Lonza/Clonetics,CC-3150）備注：培養基包含（A+B）

A :  MEBM基礎培養液 （貨號CC-3151）         

B:  細胞生長添加劑 5管 （貨號CC-4136）         5管

1)  CC-4009G      BPE            2.0ml

2)  CC-4017G      hEGF           0.5ml

3)  CC-4021G      INSULIN        0.5ml

4)  CC-4031G    HYDROCORTISONE  0.5ml

5)  CC-4081G      GA-1000         0.5ml

C: 霍亂毒素（cholera toxin）（iCell-8070） (100ng/ml) 500 ul

D:  P/S青霉素-鏈霉素 （iCell-15140-122）         5 ml

ATCC上MCF-10A細胞推薦上面的培養條件和試劑來培養該細胞，因市場長期斷貨，本公司用其它培養體系進行培養傳代驗證后已經穩定下來配方，采用的是跟ATCC上類似的無血清培養基來進行替代培養。

產品主要成分如下

基礎培養基                                                                        500mL

對應的細胞培養添加劑                                                   5mL

霍亂毒素（cholera toxin）（iCell-8070） (100ng/ml)  500 ul

P/S青霉素-鏈霉素                                                            5mL^

2）培養條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養箱濕度為70%-80%。 培養參考: 細胞消化時間25-30min (0.25%胰酶) 。傳代比例1:2，傳代周期3-4天.

注意事項:

（1）該細胞較難消化，注意延長消化時間，消化到細胞收縮變圓，輕拍培養瓶側邊，細胞可以滑落方可終止消化

（2）該細胞貼壁較慢，傳代后貼壁24~48小時后再進行后續操作。

（3） 建議使用Corning的cellbind細胞培養瓶(貨號: 3289) 進行細胞培養

（4）使用0.25%胰酶消化后，加入幾倍體積的完全培養液稀釋后（或者加入加入3-4ml用RPMI1640或者DMEM等基礎培養基配置的含10%FBS）的培養基來終止消化后，1000rpm/5min,去除胰酶后加入完全培養液進行傳代。

3）凍存液：92%完全培養基，8%DMSO，現用現配。

二． 細胞處理

1） 凍存細胞的復蘇

將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完全培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完全培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完全培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。

2） 細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。

對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法

1. 棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。

2. 加入0.25％（w / v）胰蛋白酶于培養瓶中（T25瓶1-2mL， T75  瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化25-30min (0.25%胰酶) ，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入加1ml0.1%大豆胰蛋白酶抑制劑終止消化?；蛘呒尤?-4ml含10%FBS（可用1640或者DMEM代替）的培養基來終止消化。 

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完全培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。

3）細胞凍存: 收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。

下面T25瓶為例；

1. 細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×10^6~1×10^7個活細胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞 ，按每1ml凍存液含1×10^6~1×10^7個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。

3. 將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。