骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs培養(yǎng)/誘導(dǎo)分化/成骨成脂誘導(dǎo)
產(chǎn)品名稱： 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs培養(yǎng)/誘導(dǎo)分化/成骨成脂誘導(dǎo)
英文名稱： Western Biotechnology Inc
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更新時(shí)間： 2023-07-31T09:56:51
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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞BMSCs培養(yǎng)/誘導(dǎo)分化/
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
4?周齡SD大鼠
主要試劑及儀器
DMEM/?F12培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibico?公司，CO2恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。
步驟
a．?取SD大鼠，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，移入超凈工作臺(tái)內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺(tái)面的泡沫板上。
b．?碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無(wú)菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨,剔除骨頭表面肌肉，PBS溶液沖洗兩遍。
c．?從中折斷骨頭，用2ml無(wú)菌注射器吸取PBS溶液沖出骨髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清。
d．?用含10%胎牛血清及青鏈霉素的DMEM/F12?重懸細(xì)胞，接種于無(wú)菌培養(yǎng)瓶，置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
e．?24小時(shí)后棄去培養(yǎng)液，PBS沖洗?2~?3次去除未貼壁細(xì)胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每2~?3d換液1次，7~?10d細(xì)胞生長(zhǎng)融合，經(jīng)0.25%胰酶消化，1~2傳代，其后一般3d傳代1次，選取生長(zhǎng)良好的第三代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
鑒定
胰酶消化P3代細(xì)胞，PBS洗滌2次，分別加入PE標(biāo)記CD29、CD34、CD45、CD90單克隆熒光抗體，并設(shè)同型對(duì)照，室溫避光孵育，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)志。
細(xì)胞形態(tài)
BMSCs原代培養(yǎng)過程中，約24小時(shí)即可出現(xiàn)貼壁生長(zhǎng),細(xì)胞呈圓形、梭形、三角形生長(zhǎng)緩慢。換液后細(xì)胞增殖明顯,出現(xiàn)以梭形為主的多種形態(tài)，10~14天70%?~80?%可融合達(dá)到傳代標(biāo)準(zhǔn)。傳代細(xì)胞形態(tài)單一，呈梭形或扁平型，增殖至細(xì)胞融合時(shí)呈漩渦狀和放射狀排列。
骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化
（1）收集細(xì)胞：在顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶貼壁面至70%-80%融合，在超凈工作臺(tái)上操作，先吸除培養(yǎng)瓶中舊培養(yǎng)基，用PBS洗2~3次，50mL培養(yǎng)瓶加入胰酶消化液約1-3mL，按此比例進(jìn)行消化，晃動(dòng)使消化液鋪均勻，置37度培養(yǎng)箱約2-5min，鏡下見細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3mL完全培養(yǎng)基后，輕輕吹打，收集細(xì)胞至離心管，1 000 rpm離心5 min棄上清，加培養(yǎng)液，輕輕吹打成細(xì)胞懸液。
（2）細(xì)胞接種：將上述細(xì)胞懸液接種于無(wú)菌的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，加入2mL完全培養(yǎng)基，放入CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng) 。
（3）細(xì)胞誘導(dǎo)：待細(xì)胞至50%-60%融合時(shí)，加入含50ug/lVEGF、10ug/lFGF、10%FBS的誘導(dǎo)培養(yǎng)液，放入CO2培養(yǎng)箱 37℃培養(yǎng)，連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)21d,每隔2天換液，每周傳代1次。
血管形成實(shí)驗(yàn)
(1)?將Matrigel放于4℃融化（不能放于室溫，凝固之?后不可以再用）。滅菌的100μL槍頭，24孔板冷藏備用；
(2)?開始實(shí)驗(yàn)時(shí)，從冰箱中取出冷藏的槍頭和24孔板，在24孔板每個(gè)孔中加入150μL?Matrigel。加入膠時(shí)注意保持槍頭垂直于孔中間位置，Matrigel一直保持放在冰上；
(3)?加入膠后，將整個(gè)培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，放置30min使凝膠凝固；
(4)?取經(jīng)不同濃度藥物A處理的不同代次的主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，消化后用無(wú)血清的培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度到2×105?cell/mL；
(5)?從培養(yǎng)箱中取出24孔板，每孔加入200μL細(xì)胞懸液；
(6)?蓋上蓋子后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
(7)?24h內(nèi)記錄細(xì)胞變化。
人間充質(zhì)干細(xì)胞hMSC成骨誘導(dǎo)
待細(xì)胞長(zhǎng)至基本融合后，制備完成的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液（基礎(chǔ)培養(yǎng)液+0.1μmol/L地塞米松+ 50μg/mL抗壞血酸+ 10 mmol/L β - 甘油磷酸鈉），每隔一天換液一次，誘導(dǎo)21天后再進(jìn)行礦化結(jié)節(jié)的茜素紅染色。
茜素紅染色：?
1、誘導(dǎo)后細(xì)胞爬片用PBS漂洗2x2min；
2、4%多聚甲醛處理（室溫）20min；
3、PBS漂洗，3x2min；
4、茜素紅染液染30min；
5、雙蒸水沖洗2次；
6、干燥，封片。
3T3-L1脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞
3T3-L1細(xì)胞融合至約70%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代至6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞接觸抑制2d后(誘導(dǎo)分化第0d) ，用經(jīng)典激素雞尾酒誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)前脂肪細(xì)胞分化，加入分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基1（0.5 mmol/L IBMX，1 μmol/L DEX、10ug/mL INS），72h后撤去IBMX和DEX，完全培養(yǎng)基中僅含有INS（誘導(dǎo)培養(yǎng)2），繼續(xù)培養(yǎng)3d后，僅含有10% FBS，2d換液1次，誘導(dǎo)分化8~10d。
注意事項(xiàng)：
1)?待細(xì)胞接觸抑制后2d加入誘導(dǎo)劑。太早，細(xì)胞沒有退出生長(zhǎng)周期。太遲，細(xì)胞誘導(dǎo)后容易漂浮。?
2)?3T3細(xì)胞株20代以后分化困難，最好挑選5代左右開始誘導(dǎo)分化。將細(xì)胞凍存起來，使用時(shí)再?gòu)?fù)蘇。?
3)?大約需要8~10天，可以誘導(dǎo)分化成功。之后換液處理需要輕緩，以免損失細(xì)胞。
細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
倒置顯微鏡下觀察分化前3T3-L1前脂肪細(xì)胞呈梭形，胞漿內(nèi)無(wú)脂滴，分化后3T3-L1前脂細(xì)胞呈圓形，胞漿內(nèi)含有大量的脂滴。
威斯騰生物服務(wù)流程
威斯騰生物服務(wù)項(xiàng)目
| 分子生物學(xué)檢測(cè) | 蛋白質(zhì)與免疫學(xué) | 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) |
| 實(shí)時(shí)熒光定量PCR | 單克隆抗體制備 | 帕金森疾病模型 |
| 免疫共沉淀（Co-IP） | 多克隆抗體制備 | 抑郁癥動(dòng)物模型 |
| ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）技術(shù) | Western-blot?實(shí)驗(yàn)服務(wù) | 脊髓損傷模型 |
| 生化指標(biāo)檢測(cè) | 蛋白雙向電泳實(shí)驗(yàn)服務(wù) | 腦外損傷模型 |
| 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) | 原核蛋白表達(dá)純化 | 骨神經(jīng)損傷模型 |
| 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP） | 真核蛋白表達(dá)純化 | 心肌缺血模型 |
| GST?pull?Down | ITRAQ定量蛋白質(zhì)組學(xué) | 心力衰竭模型 |
| SLAC蛋白組學(xué) | 肺動(dòng)脈高血壓動(dòng)物模型 | |
| 高血壓模型 | ||
| 病毒包裝 | 實(shí)驗(yàn)課題整體外包 | 粥樣動(dòng)脈硬化模型 |
| 過表達(dá)/干擾慢病毒包裝純化 | 整體課題外包 | 大腦中動(dòng)脈阻塞模型 |
| 過表達(dá)/干擾腺病毒包裝純化 | 細(xì)胞整體實(shí)驗(yàn)外包 | 慢性之氣管炎模型 |
| 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝純化 | 動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)外包 | 過敏性哮喘模型 |
| 腺相關(guān)病毒包裝純化 | 肺炎大鼠模型 | |
| 肝炎-肝硬化-肝癌模型 | ||
| 蛋白芯片 | 原代細(xì)胞培養(yǎng) | 肝纖維化模型 |
| 細(xì)胞因子芯片 | 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng) | 膽結(jié)石模型 |
| BioPlex懸浮芯片 | 脂肪干細(xì)胞培養(yǎng) | 急性胰腺炎模型 |
| 生長(zhǎng)因子芯片 | 心肌成纖維細(xì)胞培養(yǎng) | 急性腎衰竭模型 |
| 炎癥因子芯片 | 軟骨細(xì)胞培養(yǎng) | 體內(nèi)血栓模型 |
| 血管生成因子芯片 | 血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) | 關(guān)節(jié)炎模型 |
| 凋亡因子芯片 | 神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) | I型和II型糖尿病模型 |
| 趨化因子芯片 | 內(nèi)皮組細(xì)胞原代培養(yǎng) | 裸鼠成瘤 |
| HuProt?TM?20K人類蛋白組芯片 | 基因編輯動(dòng)物 | |
| 電生理相關(guān)服務(wù) | 動(dòng)物整體實(shí)驗(yàn)服務(wù) | |
| 膜片鉗實(shí)驗(yàn) | ||
| 細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) | 高通量測(cè)序 | 代謝組學(xué) |
| 細(xì)胞原代培養(yǎng) | mRNA測(cè)序 | 氣相色譜GC/MS |
| MTT檢測(cè) | LncRNA測(cè)序 | 液相色譜LC/MS |
| 細(xì)胞凋亡檢測(cè) | 全基因組測(cè)序 | 核磁共震NMR |
| 細(xì)胞周期檢測(cè) | RNA-Seq測(cè)序 | |
| 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) | 外顯子測(cè)序 | 影像學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn) |
| Transwell細(xì)胞遷移/侵襲 | 16s擴(kuò)增子測(cè)序 | Micro-CT |
| 流式分選 | Small?RNA測(cè)序 | 小動(dòng)物活體成像 |
| CCK8/XTT檢測(cè) | 宏基因組測(cè)序 | 核磁共振 |
| 臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活性 | 單細(xì)胞測(cè)序 | PET-CT |
| 藥物篩選細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn) | circleRNA測(cè)序 | |
| 細(xì)胞粘附性檢測(cè) | 甲基化測(cè)序 | 基因編輯動(dòng)物 |
| 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) | 條件性敲除小鼠/大鼠 | |
| 細(xì)胞生物學(xué)整體實(shí)驗(yàn) | 全基因敲除小鼠/大鼠 | |
| 細(xì)胞成管實(shí)驗(yàn) | ||
| 病理檢測(cè) | CRISPR/Cas9細(xì)胞敲除/敲入 | 基因芯片 |
| 掃描電鏡 | 基因定點(diǎn)突變細(xì)胞系 | LncRNA芯片 |
| 透射電鏡 | 單基因敲除細(xì)胞系 | miRNA芯片 |
| HE染色 | 多基因敲除細(xì)胞系 | mRNA芯片 |
| 免疫組化 | 目的基因敲入細(xì)胞系 | 甲基化芯片（限人和小鼠來源樣本） |
| Tunel（原位末端凋亡法）檢測(cè) | 報(bào)告基因敲入細(xì)胞系 | SNP芯片（限人和小鼠來源樣本） |
| 激光共聚焦 | miRNA/LncRNA敲除細(xì)胞系 | |
| 免疫熒光 | ||
| Masson染色 | TUNEology 波長(zhǎng)可調(diào)檢測(cè)卡盒-->
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