?詳細說明

表達各種鈉離子通道亞型的穩定細胞系信息如下???

? 鈉通道穩定表達的HEK293細胞系在含有10%?胎牛血清及1.2mg/ml?G418的DMEM培養基中培養，培養溫度為37℃，二氧化碳濃度為5%。

? 細胞傳代：除去舊培養基并用PBS洗一次，然后加入1 ml TrypLE? Express溶液，37°C孵育1分鐘。當細胞從皿底脫離，加入5 ml 37°C預熱的完全培養基。將細胞懸液用吸管輕輕吹打使聚集的細胞分離。將細胞懸液轉移至無菌的離心管中，1000rmp離心5分鐘收集細胞。擴增或維持培養，將細胞接種于10厘米細胞培養皿，每個細胞培養皿，接種細胞量為3.5*10⁵?cells（最終體積：10 ml）。

? 為維持細胞的電生理活性，細胞密度必須不能超過80%。

? 膜片鉗檢測，實驗之前細胞用TrypLE???Express分離，將3*10³?細胞鋪到蓋玻片上，在24孔板中培養（最終體積：500μl），18個小時后，進實驗檢測。

電生理檢測方法

? ? ?用微電極拉制儀（P97，Sutter Instruments）將毛細玻璃管（BF150-86-10，Sutter Instruments）拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡（IX71，Olympus）下操縱微電極操縱儀（MP285，Sutter Instruments）將記錄電極接觸到細胞上，給予負壓抽吸，形成GΩ封接。形成GΩ封接后進行快速電容補償，然后繼續給予負壓，吸破細胞膜，形成全細胞記錄模式。然后進行慢速電容的補償并記錄膜電容及串聯電阻。不給予漏電補償。當全細胞記錄的電流穩定后開始給藥，每個藥物濃度作用至5分鐘后檢測下一個濃度，在記錄期間獨立重復檢測多個細胞。所有電生理實驗均在室溫下進行。實驗數據由?EPC-10?放大器(HEKA)進行采集并儲存于PatchMaster (HEKA)軟件中。

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檢測實驗的刺激方案：

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數據質量標準

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(1)?串聯電阻?≤ 20 MΩ；

(2)?封接電阻?≥ 1 GΩ；

(3)?起始電流幅度適宜；

(4)?電流沒有明顯的自發性衰減(5分鐘內自發性衰減小于5%)；

(5)?在膜電位為-80mV下無明顯的漏電流?(漏電流?≤ 100 pA)。

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數據分析

首先將每一個藥物濃度作用后的電流和空白對照電流標準化(),然后計算每一個藥物濃度對應的抑制率(1-)。對每一個濃度計算平均數和標準誤，?并用以下的方程計算每種化合物的半抑制濃度：

? ? 用以上方程對劑量依賴效應進行非線性擬合，?其中c代表藥物濃度，IC50為的半抑制濃度，h代表希爾系數。曲線擬合以及IC50的計算利用IGOR軟件完成。

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NaV1.1

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NaV1.2

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NaV1.3

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NaV1.5

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