產品簡介

Annexin V-Alexa Fluor 488/PI凋亡檢測試劑盒利用帶有Alexa Fluor 488標記的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發生，可通過流式細胞儀或其他熒光檢測設備進行檢測。

試劑盒檢測原理如下：在正?；罴毎?，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內側；在早期凋亡的細胞中，PS從細胞膜的內側翻轉到細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。Annexin-Ⅴ（膜聯蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力結合。因此，它能夠通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI聯合使用時，PI則被排除在活細胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被Alexa Fluor 488和PI結合染色呈現雙陽性（Annexin V+/PI+）。

產品規格

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。-20℃避光長期保存，避免反復凍融，一年有效。如果需要在短時間內多次重復使用，可以在4℃避光保存，半年有效。

注意事項

1、由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后1小時之內進行分析。

2、對于貼壁細胞，消化是一個關鍵步驟。貼壁細胞誘導細胞凋亡時如有漂浮細胞，需收集漂浮細胞和貼壁細胞后合并染色。處理貼壁細胞時要小心操作，盡量避免人為損傷細胞。胰酶消化時間過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷，PI攝入過多；消化時間過長，細胞膜同樣易造成損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-Alexa Fluor 488的結合。消化時將胰酶鋪滿孔板底后，輕搖時胰酶與細胞充分接觸，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段時間，待細胞間空隙增大，瓶底呈花斑狀即可終止。在消化液中盡量不用EDTA，EDTA會影響Annexin V與PS的結合。

3、如果樣品來源于血液，請務必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結合，從而干擾實驗結果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

4、試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

5、Annexin V-Alexa Fluor 488和PI是光敏物質，在操作時請注意避光。

6、本產品僅用于科研。

使用說明

1、樣品染色

1）懸浮細胞：300 g，4℃離心5 min收集細胞。貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃離心5 min收集細胞。胰酶消化時間不宜過長，以防引起假陽性。

2）用4℃預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均需300g，4℃離心5 min。

3）吸棄PBS，加入100 μL 1×Binding Buffer重懸細胞。

4）加入5 μL Annexin V-Alexa Fluor 488和10 μL PI，輕輕混勻。

5）避光、室溫反應15 min。

6）加入400 μL 1×Binding Buffer，混勻，樣品在1小時內用流式細胞儀檢測。

【注意】為了避免洗滌細胞時損失細胞，在吸液時可以用大的Tip頭套上小的Tip頭吸液。

2、流式細胞儀分析

Alexa Fluor 488最大激發波長為488 nm，最大發射波長為519 nm；PI-DNA復合物的最大激發波長為535 nm，最大發射波長為615 nm。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），Alexa Fluor 488為橫坐標，PI為縱坐標。每個樣采集10,000 events。

3、熒光顯微鏡分析

1）滴一滴用Annexin V-Alexa Fluor 488/PI雙染的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。

2）在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-Alexa Fluor 488熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。