Hieff Clone® Universal II One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優化的第二代2× Hieff Clone® Universal II Enzyme Premix預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了獨特的重組增強因子，用于同源重組可顯著提高重組克隆效率。

該試劑盒可以將PCR產物定向克隆至任何載體的任何位點，兼容未純化PCR產物、直接回收的PCR產物、低濃度的膠回收產物，本產品可重組同源臂GC含量30%-70%的接頭片段。將載體完全線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的完全一致的序列。PCR產物和線性化載體在重組酶的作用下，在50℃條件下最快僅需5 min即可完成重組反應。克隆陽性率可達95%以上。

組分信息

儲存條件

-25~-15℃保存，有效期1年。

簡版使用說明

 1.重組反應

   1)線性化載體和插入片段使用量

Hieff Clone^®重組反應體系各個片段及載體插入總濃度為0.02 - 1 pmol。載體與各個插入片段摩爾比為1:2*。對應的DNA質量可由以下公式計算獲得：

pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對數 × 650 daltons)
50 ng 5,000 bp的DNA片段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA片段約為0.15 pmol

*當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應互換，即插入片段當做載體，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的反應終濃度最低可達到1 ng/μL。線性化載體和插入片段擴增產物未純化直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

簡便的投入量計算公式：插入片段投入量=2×插入片段長度×插入載體投入質量/載體長度

 2)重組反應體系（可等比擴大或縮減反應體系，冰上配制，各組分使用前需混勻）

表1 反應體系

3)重組反應條件

1. 體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。
2. 當插入1個片段時，反應條件為50℃，5 min；當插入片段數為2-6個時，建議反應條件為50℃，10 -50 min（反應時間隨片段數增多而延長，如表2所示）。超長載體片段連接，建議反應時間為40-60 min。

表2 反應時間

1. 反應產物可直接進行轉化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉化。

1. 轉化

1. 提前15分鐘將用到的篩選培養基平板拿到37℃預熱。
2. 在冰上解凍快速克隆感受態細胞（如：DH5α Fast Chemically Competent Cell，Cat#11803ES）。
3. 取10 μL冷卻重組產物，加入到100 μL感受態細胞中，輕彈管壁數下混勻，在冰上放置5 min。
4. 用200 μL移液槍將上一步的混合物轉移到已經37℃預熱的LB培養基上，均勻涂布。
5. 將平板置于37℃培養箱倒置過夜培養。若進行藍白斑篩選操作，平板在37℃至少倒置培養15 h。

1. 克隆鑒定

最方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至菌落PCR Mix中混勻（如：2×Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)，Cat#10157ES），加入引物直接進行PCR反應。推薦至少使用一條通用測序引物進行菌落PCR，可以避免PCR假陽性的產生。后續也可用于酶切或測序鑒定。

注意事項

1.需自備的材料：

     1)自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。

     2)自備試劑（僅羅列部分）：

1. 超級感受態：轉化效率＞10⁸ cfu/μg，如翌圣DH5α快速化學感受態細胞（Cat#11803ES）。
2. 高保真酶：2× Hieff Canace^® AdvanceFast PCR Master Mix (With Dye)（Cat#10164ES）或其他等效產品。
3. 菌落PCR mix：2× Hieff^® Ultra-Rapid HotStart PCR Master Mix (with Dye)（Cat#10157ES）或其他等效產品。
4. 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000× in Water)（Cat#10202ES）或其他等效產品。

     3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等。

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 本產品僅作科研用途！

Ver. CN20231024