產品簡介

TUNEL Apoptosis Detection Kit, Alexa Fluor 640 細胞凋亡檢測試劑盒可以用來檢測組織細胞在晚期凋亡 過程中細胞核 DNA 的斷裂情況。檢測原理：在末端脫氧核糖核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT） 的作用下 ，基因組 DNA 斷裂時暴露出的 3 ´-羥基（3 ´-OH）末端摻入 Alexa Fluor

640-12-dUTP ，因此可以用熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測。Alexa Fluor 640 染料穩定性更高 ，信號更強， 從而使標記物更亮 ，抗淬滅能力更強。

本試劑盒應用范圍廣 ，可用于檢測冷凍或石蠟切片中的細胞凋亡情況 ，也可檢測培養的貼壁細胞或懸浮細 胞的凋亡情況。

產品規格

組分信息

儲存條件

冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒儲存在-20℃ ,  Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix 避光儲存于-20℃ , 有效期為 1 年。

注意事項

1.     需自備用于洗滌細胞的 PBS ，用于封片的抗熒光淬滅封片液 ，用于固定的 4%多聚甲醛。

2.     為了您的安全和健康 ，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

3.     本產品僅用于科研。

使用說明

1.     樣品準備

1)      石蠟包埋組織切片

a.      室溫下將石蠟組織切片放入二甲苯中浸泡 5 min ，重復一次 ，以徹底脫掉石蠟。

b.      室溫下用 100%乙醇浸泡切片 5 min ，重復一次。

c.      室溫下用梯度乙醇（90、80、70%）各浸洗 1 次 ，每次 3 min。

d.     用 PBS 輕輕潤洗切片 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣 品周圍描繪樣品分布的輪廓，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中切勿讓樣品干燥，處 理好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

e.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作為稀釋液來稀釋 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其終濃度為 20 μ g/mL。

f.       每個樣本上滴加100  μL 濃度為 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育 20 min。 【注】 Proteinase K 幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗

滌步驟中從載波片上脫落的風險 ，過短則可能造成透性處理不充分 ，影響標記效率。為得到更好的結果， 可能需要優化 Proteinase K 孵育的時間。

g.      PBS 溶液潤洗樣本 2-3 次 ，輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理 后的樣本放在濕盒中保持樣本濕潤。

2)      組織冰凍切片

a.      取出冰凍切片 ，并回溫至室溫。將玻片浸沒在 4%多聚甲醛溶液（溶于 PBS） 中固定 ，室溫下孵育 30 min。

b.      輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余的液體。

c.      將玻片浸沒在 PBS 溶液中 ，室溫孵育 15 min ，重復 PBS 洗一次 ，共 2 次。

d.      輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。此時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周 圍描繪樣品分布的輪廓 ，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥 ，處理 好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

e.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作為稀釋液來稀釋 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其終濃度為 20 μ g/mL。

f.       每個樣本上滴加100  μL 濃度為 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育 10 min。 【注】 Proteinase K 幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗

滌步驟中從載波片上脫落的風險 ，過短則可能造成透性處理不充分 ，影響標記效率。為得到更好的結果， 可能需要優化 Proteinase K 孵育的時間。

g.      在盛有 PBS 溶液的敞口燒杯中潤洗樣本 2-3 次。

【注】為了避免在清洗步驟中的樣本脫片損失 ，建議不用洗瓶清洗 ，而是將玻片浸在 PBS 溶液中 2-3 次進 行清洗。

h.      輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的樣本放在濕盒中保存樣本 的濕潤。

3)      細胞樣品

a.      在 Lab-Tek 載波片小室（Chamber Slides）上培養貼壁細胞。在凋亡誘導處理之后，用 PBS 洗 2 遍 載玻片。

b.      多聚賴氨酸包被的載玻片的準備：吸取 50-100  μL 0.01%(w/v)多聚賴氨酸水溶液滴至每一片預清洗 過的玻璃載玻片的表面。在將要用于固定細胞的區域將多聚賴氨酸溶液涂散為一薄層。待載玻片晾干 之后 ，迅速用去離子水漂洗 ，然后讓包被后的載玻片在空氣中晾干 30-60 min。包被后的載玻片能在 室溫儲存數月。

c.      以約 2×107 個細胞/mL 的濃度將細胞重懸于 PBS 中 ，吸取 50-100  μL 細胞懸液滴于多聚賴氨酸包 被的載玻片上 ，用一片干凈的載玻片輕柔的涂開細胞懸液。

d.      固定細胞 ，將載玻片浸入裝有 4%新鮮配制于 PBS 中的多聚甲醛的染色缸中 ，在 4℃放置 25 min。

e.      洗滌載玻片 ，將其浸入 PBS 中 ，室溫放置 5 min。重復用 PBS 洗一次。

f.       輕輕去掉多余液體，并用濾紙小心吸干玻片上樣本周圍多余液體。這時可用石蠟筆或疏水筆在樣品周 圍描繪樣品分布的輪廓 ，便于下游透性處理和平衡標記操作。在實驗過程中，切勿讓樣品干燥 ，處理 好的樣本放在濕盒中保持樣本的濕潤。

g.      按 1:100 的比例 ，用 PBS 作為稀釋液來稀釋 2 mg/mL 的 Proteinase K 溶液 ，使其終濃度為 20 μ g/mL。

h.      每個樣本上滴加 100  μL 濃度為 20  μg/mL 的 Proteinase K 溶液，使其被全部覆蓋，室溫孵育 5 min （也可浸于 0.2%配制于 PBS 中的 Triton X-100 溶液中 ，室溫孵育 5 min 進行通透處理）。

【注】 Proteinase K 幫助組織和細胞對后續步驟的染色試劑通透。孵育時間過長會增加組織切片在后續洗 滌步驟中從載波片上脫落的風險 ，過短則可能造成透性處理不充分 ，影響標記效率。為得到更好的結果 ， 可能需要優化 Proteinase K 孵育的時間。

i.       PBS 潤洗樣本 2-3 次 ，輕輕去掉多余液體 ，并用濾紙小心吸干載玻片上樣本周圍的液體。處理后的 樣本放在濕盒中。

2.     DNA 酶處理陽性對照的步驟

在樣本通透處理后，用 DNA 酶 I 處理細胞來準備陽性對照載玻片。該流程通常會引起被處理的大多數細胞 顯現綠色熒光。

【注】 DNA 酶 I 處理固定的細胞會引起染色體 DNA 的斷裂 ，產生許多可標記的 DNA 3 ´-末端。

1)      按 1:10 的比例用去離子水稀釋 10×DNase I Buffer(每個樣本需用 200 µL 1×DNase I Buffer，即需 要用 20 µL 10×DNase I Buffer 和 180 µL 去離子水混合稀釋) ，取其中 100 µL 滴加到已通透的樣本  上，室溫孵育 5min。 向剩余 100  μL 1×DNase I Buffer 中加 1  μL DNase I (1U/μL)，使其終濃度為 10 U/mL。

2)      輕輕叩掉液體 ，加入 100  μL 含 10 U/mL DNase I  的緩沖液 ，室溫孵育 10 min。

3)      輕叩載玻片 ，去掉多余的液體 ，并將載玻片在裝有去離子水的染色缸中徹底洗 3-4 次。

【注】 陽性對照載玻片必須使用單獨的染色缸 ，否則陽性對照載玻片上殘余的 DNase I  可能會在實驗載玻 片上引入高背景。

3.     標記與檢測

1)      按 1:5 的比例用去離子水稀釋適量 5×Equilibration Buffer（每個樣品需要 100  μL 1×Equilibration Buffer）。

2)      每個樣本滴加 100  μL 1×Equilibration Buffer 使其全部覆蓋待檢樣本區域 ，室溫孵育 10-30 min。 或者將載玻片放入一個含有 1×Equilibration Buffer 的缸中，保證緩沖液沒過樣本。在平衡細胞的同 時在冰上解凍 Alexa Fluor 640-12-dUTP Labeling Mix ，并依照表 1 ，準備足夠量的用于所有實驗的  和可選陽性對照反應的 TdT 孵育緩沖液。對于面積小于 5 cm2 的一個標準反應，其體積是 50  μL，用50 μL 乘以實驗和陽性對照反應的數目來確定所需 TdT 孵育緩沖液的總體積。對于表面積更大的樣 本 ，可成比例的增大試劑體積。

表 1  準備用于實驗的和可選陽性對照反應的 TdT 孵育緩沖液

陰性對照體系：準備一份不含 TdT 酶的對照孵育緩沖液 ，用 ddH2O 替代 TdT 酶。

3)      在平衡后的區域周圍用吸水紙洗掉 100  μL 1×Equilibration Buffer 中的大部分，然后在 5 cm2 面積 的細胞上加入 50 μL TdT 孵育緩沖液。不要讓細胞干掉。這之后的操作 ，載玻片要避光。

4)      把塑料蓋玻片蓋在細胞上以保證試劑的平均分布，在濕盒的底部放上用水浸濕的紙巾。將載玻片置于 濕盒內 ，在 37℃孵育 60 min。將濕盒用鋁箔紙包裹以避光。

【注】 塑料蓋玻片在使用前可以切成兩半。折起蓋玻片的邊緣以便于移除和操作。

5)      移除塑料蓋玻片 ，并將切片置于 PBS 溶液中室溫孵育 5 min ，換用新鮮 PBS 再重復清洗 2 次。

6)      用濾紙輕輕擦掉樣本周圍及背面的 PBS 溶液。

【注】 為了降低背景 ，載玻片在用 PBS 洗一遍后 ，可再用含 0.1% Triton X-100 和 5 mg/mL BSA 的 PBS 洗 3 次 ，每次 5 min ，這樣游離的未反應的標記物可以清楚較干凈。

7)      樣本在染色缸中染色，在黑暗中將載玻片浸入裝有 PI 溶液（1  μg/mL，用 PBS 新鮮配制并稀釋）的 染色缸 ，室溫放置 5 min。（可選） ：樣本在染色缸中染色 ，在黑暗中將載玻片浸入裝有 DAPI 溶液  （2  μg/mL ，用 PBS 新鮮配制并稀釋） 的染色缸 ，室溫放置 5 min。

8)      洗滌樣本 ，將載玻片浸入去離子水中 ，室溫放置 5 分鐘。重復兩次 ，總共洗三次。

9)      叩干載玻片上多余的水并向樣本區域加 100  μL PBS 保持樣本濕潤。、

10)    立即在熒光顯微鏡下分析樣本 ，在 620 nm 下檢測 Alexa Fluor 640-12-dUTP 紅色熒光 ，在 460 nm 觀察藍色的 DAPI。DAPI 能將凋亡和未凋亡的細胞都染成藍色，只在凋亡的細胞核中才有 Alexa Fluor 640-12-dUTP 摻入而定位的紅色熒光。如有必要 ，載玻片能在 4℃黑暗條件下存放過夜。

【注】 PI/DAPI 能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色 ，只在凋亡的細胞核中才有 Alexa Fluor 488-12-dUTP Labeling Mix 摻入而定位的綠色熒光。