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在表觀遺傳學與蛋白質組學快速融合的今天，組蛋白翻譯后修飾正在成為解析基因表達調控機制的關鍵入口。其中，近年來備受關注的組蛋白丙二酰化，因其與細胞代謝狀態密切相關，逐漸成為代謝表觀遺傳交叉研究的重要熱點。然而，與經典乙酰化、甲基化相比，Kmal 的位點鑒定仍面臨靈敏度低、背景干擾強以及數據庫支持不足等挑戰。

一、組蛋白丙二酰化的生物學背景

組蛋白丙二酰化是一種賴氨酸殘基的酰化修飾，其修飾基團來源于細胞代謝中間產物，丙二酰輔酶A（malonyl-CoA）。該修飾最早在代謝酶研究中被發現，隨后在組蛋白上被證實具有廣泛分布。

從功能上看，Kmal 可能通過以下方式影響染色質狀態：

• 改變組蛋白正電荷，降低DNA結合能力
• 參與染色質開放與轉錄激活
• 與細胞能量代謝狀態（脂肪酸合成、糖代謝）高度耦合
• 與乙酰化、琥珀酰化等競爭性修飾形成調控網絡

因此，精準鑒定Kmal位點，不僅是蛋白質組學技術問題，更是理解代謝調控表觀遺傳的重要突破口。

二、組蛋白丙二酰化位點鑒定的技術路線概述

目前主流的Kmal位點鑒定策略主要基于質譜（mass spectrometry, MS）驅動的蛋白質組學方法，通常結合富集策略與生物信息學分析。

整體流程可分為三大模塊：

• 樣本制備與組蛋白提取
• 丙二酰化肽段富集與酶解
• LC-MS/MS檢測與數據庫搜索

其中，核心技術瓶頸集中在低豐度修飾肽段的富集與高精度鑒定。

三、核心技術：質譜在Kmal位點鑒定中的作用

在當前組蛋白修飾研究中，高分辨率液相色譜串聯質譜（LC-MS/MS）是最可靠的檢測手段。

其優勢包括：

• 可實現高靈敏度低豐度修飾檢測
• 能區分多種相近質量修飾（如乙酰化 vs 丙二酰化）
• 支持多修飾并行分析（multi-PTMs profiling）
• 可定位具體賴氨酸修飾位點

常用儀器平臺包括 Orbitrap 系列高分辨質譜系統，其高質量精度（ppm級）對于區分丙二酰化（+86.0004 Da）尤為關鍵。

四、組蛋白丙二酰化位點鑒定的關鍵實驗流程

1、組蛋白提取與純化

組蛋白通常來源于細胞核組分，提取步驟包括：

• 細胞裂解（低鹽緩沖體系）
• 酸性提取（0.2 M HCl常用于富集組蛋白）
• TCA/丙酮沉淀純化
• SDS-PAGE或質控檢測純度

高質量組蛋白樣本是后續質譜成功的基礎。

2、蛋白酶解與化學衍生化

由于組蛋白賴氨酸位點密集，常采用：

• 胰蛋白酶（Trypsin）定向酶解
• 或結合Lys-C提高覆蓋度

在部分策略中，還會進行化學衍生化（propionylation），以阻斷非修飾賴氨酸，提高Kmal檢測特異性。

3、丙二酰化肽段富集策略

由于Kmal在細胞內豐度較低，富集步驟至關重要：

（1）抗體富集

利用特異性抗丙二酰化賴氨酸抗體進行免疫沉淀，是目前最常用方法。

• 優點：高特異性，可直接用于復雜樣本
• 缺點：抗體依賴性強，成本較高

（2）化學富集方法

基于修飾基團化學特性進行選擇性捕獲，但目前應用相對有限。

4、LC-MS/MS檢測參數優化

在質譜分析中，需要重點優化以下參數：

• MS1分辨率：≥60,000（Orbitrap）
• MS2碎裂方式：HCD（Higher-energy collisional dissociation）
• 動態排除（Dynamic exclusion）減少重復掃描
• 質量窗口：±10 ppm以內

丙二酰化修飾質量增加約 +86.0004 Da，是數據庫搜索的重要標志。

5、數據庫檢索與位點確認

常用軟件包括：MaxQuant、Proteome Discoverer、Mascot。

盡管質譜技術不斷進步，但Kmal研究仍存在多個瓶頸：

1、修飾豐度低

Kmal在生理條件下含量遠低于乙酰化，容易被背景信號掩蓋。

2、修飾競爭性強

同一賴氨酸位點可能同時存在：乙酰化、琥珀酰化、丙二酰化，導致譜圖解析復雜。

3、抗體特異性問題

商業抗體可能存在交叉反應，影響富集準確性。

4、數據庫標注不足

相比經典PTM，Kmal在公共數據庫中的注釋仍不完善。

組蛋白丙二酰化作為新興的代謝相關表觀遺傳修飾，其位點鑒定依賴于高靈敏質譜技術與高效富集策略的結合。盡管目前仍面臨豐度低、譜圖復雜等挑戰，但隨著高分辨質譜與多組學整合的發展，Kmal研究正在進入快速發展階段。未來，圍繞Kmal位點的系統性解析，將有望進一步揭示細胞代謝狀態如何精準調控基因表達，從而推動精準醫學與功能蛋白組學的發展。百泰派克生物科技長期專注于蛋白質組學與翻譯后修飾分析服務，圍繞Kmal等低豐度修飾提供一體化解決方案。

百泰派克生物科技特色項目

一、蛋白測序

百泰派克生物科技使用Thermo公司新推出的Obitrap Fusion Lumos質譜儀及島津公司埃德曼降解測序系統對蛋白質序列進行分析，提供基于質譜的蛋白測序分析服務，包括對蛋白質的氨基酸組成分析，N端測序，C端測序和全序列分析，以及基于埃德曼降解的蛋白質N端序列分析服務。對于未知理論序列的蛋白質，提供基于從頭測序法的蛋白質從頭測序服務，對蛋白序列進行分析。

※服務優勢：

1.采用目前世界上先進的質譜儀器 Obitrap Fusion Lumos;

2.可實現對所測定靶蛋白序列 100% 的覆蓋;

3.可測定蛋白N端多達 70個氨基酸序列;

4.可測定多種形式的樣品: 蛋白溶液、PVDF 蛋白條帶;

5.樣品用量低: 蛋白樣品僅需 5-10ug，即可完成檢測;

6.測序不受N端封閉，PEC和和糖基化等N端修飾的影響。

二、蛋白質組學

百泰派克生物科技采用Thermo Fisher的Orbitrap Fusion Lumos質譜平臺結合Nano-LC，提供定量蛋白質組學、靶向蛋白質組學、多肽組學、翻譯后修飾蛋白組學等多種蛋白質組學分析服務。此外，百泰派克生物科技新推出基于timsTOF Pro的4D蛋白質組學服務，助力微量樣本蛋白組學、大樣本群醫學及高通量修飾組學等研究工作。

※服務優勢：

1 .高通量定量蛋白分析:多對照組大規模實驗分析，發現新的生物標記物;

2.體內體外多種蛋白質標記方法，適用于分析組織、細胞、血液等多種樣品;

3.質譜分析靈敏度高，實驗結果重復度高;

4.可檢測較低豐度蛋白，線性范圍廣;

5.專業生物信息學分析，分析更系統準確。

三、單細胞質譜流式技術分析

百泰派克生物科技采用Fluidigm質譜流式系統進行單細胞質譜流式技術分析，采用金屬元素標記物（通常是金屬元素標記的特異抗體）標記細胞表面和內部的分子，然后用流式細胞原理分離單個細胞，再用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）分析單個細胞的原子質量譜，最后將原子質量譜數據轉換為細胞表面和內部的信號分子表達量。

※服務優勢：

1.技術先進，填補技術空白

采用金屬標記抗體技術，避免了傳統流式熒光通道少且易相互影響的問題。可在單細胞層面上對多種指標同時進行表征，百泰派克生物科技可做到同時檢測51個目標蛋白。

2.分析數量大，成本較低

單細胞RNAseq受成本等因素限制，所有樣本細胞匯總的分析數目一般在2x10^4個左右，而流式質譜技術一次（單樣本）就可分析至少10^5的細胞，實現了數量級的提高，且成本不高于單細胞RNAseq。

3.應用前景大

①流式質譜結果可以給出細胞亞群的變化，在臨床診斷、疾病機制研究等方面具有極大的研究前景；

②將金屬標簽技術與其他技術結合會有新應用方向。除常規蛋白外，質譜流式細胞技術還可用于蛋白翻譯后修飾；

③可檢測細胞存活率、細胞大小、mRNA轉錄子表達量、DNA合成速率以及蛋白酶活性等。

四、基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現

百泰派克生物科技的基于高精度質譜的免疫多肽組學分析及新抗原發現一站式解決方案包括我們專有的、高度敏感的免疫肽富集和鑒定方案。我們能夠幫助您實現10,000個以上I型多肽和10,000個以上II型多肽的鑒定和識別。通過我們優化的高通量免疫多肽組學分析平臺進行免疫肽組學分析，可從最小的樣品材料中進行可重復的識別和定量。該服務可以應用于大規模的研究，旨在助力科研工作者尋找癌癥、免疫疾病及傳染病的解決方案，深入挖掘未知的靶標。

五、生物藥物表征

百泰派克基于高分辨率質譜技術，MALDI TOF，高效色譜分離技術，提供一系列完善的生物藥物分析方案，從蛋白質、多肽、抗體、疫苗等生物制品的氨基酸組成和一級結構分析，到產品變異性和純度分析。旨在提供優質生物藥物分析服務，幫助生物醫藥生產商提高生物藥物品質。

百泰派克生物科技七大檢測平臺

百泰派克生物科技-生物制品表征，生物質譜多組學優質服務商

北京百泰派克生物科技有限公司致力于為生物/制藥和醫療器械行業提供質量控制檢測和項目驗證等專業服務。公司實驗室遵循NMPA、ICH、FDA和EMA等的法規和指導原則，通過CNAS/ISO9001雙重質量體系認證，建立了完備的質量體系，數據冷熱/異地備份，設備定期計量/期間核查，軟件審計追蹤，為客戶提供一體化解決方案和技術服務，支持新藥研發、藥物申報注冊和生產放行。

1.公司采用ISO9001質量控制體系，專業提供以質譜為基礎的CRO檢測分析服務；

2.獲國家CNAS實驗室認可，為客戶提供符合全球藥政法規的藥物質量研究服務；

3.業務范圍覆蓋蛋白質組學、多肽組學、代謝組學、生物藥物表征、單細胞分析、單細胞質譜流式、生信云分析以及多組學生物質譜整合分析等；

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