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【用途】本試劑盒采用實時熒光?RT-PCR?方法檢測偶蹄動物水泡皮、水泡液及?OP?液中的塞尼卡病毒（SVV）的?RNA，適用于?SVV?的檢測、診斷和流行病學調查。

【原理】提取樣品?RNA，在高效反轉錄酶的作用下，以?RNA?為模板，以引物為起點合成與?RNA?模板互補的?cDNA?鏈。在熱啟動?Taq?酶的作用下，?經高溫變性、中溫退火及延伸的循環，使特異

DNA?片段的拷貝數放大一倍，經熒光素標記的探針與擴增的?DNA?雜交，利用?Taq?聚合酶的?5→3?外切活性，使熒光探針的報告基團與淬滅基團分離，發出特異性熒光信號，利用熒光?PCR?儀檢測特異性熒光信號，根據樣品?Ct?值的大小及擴增曲線的形成情況判定結果。

【試劑盒組成】

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【需要自備的器材】

1．試劑：核酸提取試劑。

2．儀器：離心機、熒光?PCR?擴增儀、-20℃冰箱、可調移液器（2μL、20μL?、200μL、1000μL）。

3．耗材：熒光?PCR?專用反應管、吸頭（10μL、

200μL、1000μL）。

【使用注意事項】

1．建議與世紀元亨提供的柱式?RNA?核酸提取試劑盒配套使用。

2．實驗過程中進行陰性對照和陽性對照樣品的

質量控制。

3．所有接觸病料的物品均應合理處置，以免污染實驗室。

4．PCR?整個試驗分配液區、模板提取區、擴增區。流程順序為配液區→模板提取區→擴增

區。嚴禁器材和試劑倒流。

5．所有試劑應在規定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應完全融化，8000rpm?離心

15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，?使用后立即放回-20℃。

6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7．嚴格遵守操作說明可以獲得最好的結果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。

配制，整個實驗過程嚴格控制污染。

9．反復凍融試劑將降低檢測靈敏度，本試劑盒應在?3?次內用完。

【樣品采集】

病死或撲殺動物，取水泡皮及水泡液；待檢活動物，取?OP?液?2～3?mL。2～8?℃保存，送實驗室檢測。要求送檢病料新鮮，嚴禁反復凍融。

【實時熒光?RT-PCR?操作】

設被檢樣品、陰性對照和陽性對照總和為?N，?則反應體系配制如下：

試劑 體系

無菌無核酸酶水 7（N+1）μL

RT-PCR?反應液 12.5（N+1）μL

酶混合液 1（N+1）μL

??熒光探針 2.5（N+1）μL

將以上配制的反應體系充分混勻后，分裝每個反應管中各?23μL。分別取?2μL?模板?RNA，加入相應反應管中，混勻并作好標記，其中?SVV?熒光報告基團為?FAM，淬滅基團均為?None。在熒光?PCR?儀上進行以下反應：42?℃?5?min，95?℃?10?s；95?℃?5?s，60?℃?35?s，在每個循環第二步（60℃

35s）收集熒光信號，共?40?個循環。

【結果判定】

1?結果分析條件設定

閾值設定原則：閾值線設定于剛好超過陰性對照擴增曲線的最高點。不同儀器可根據儀器噪音情況進行調整。?????????????????????????2?結果描述及判定

陽性對照?Ct?值≤30?并出現特異性擴增曲線，?陰性對照無?Ct?值并且無特異性擴增曲線，實驗結果成立；被檢樣品若FAM?熒光信號?Ct?值≤30?并出現特異性擴增曲線為?SVV?陽性；被檢樣品?30

＜Ct＜36?并出現特異性擴增曲線，需重新取樣提取?RNA，擴增后進行結果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品?Ct?值≥36?時，超過本方法檢測靈敏度范圍，判定為陰性；對于某些未呈現特異性擴增曲線，但本底較高的樣品，判為陰性。

【規格】50?頭份/盒

【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期為?12

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