Cas9 KO穩定株構建
產品名稱： Cas9 KO穩定株構建
英文名稱： CRISPR cas9 KO stable cell construction
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Cas9 KO 穩定株構建
?一、產品描述
CRISPR/Cas9通過對靶DNA序列進行切割，利用細胞的非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ）修復機制在DNA切割處隨機產生Indels突變，從而導致編碼基因讀碼框發生改變，產生功能缺失的蛋白，達到對該基因敲除的目的。通過對CRISPR/Cas9轉染或感染的細胞進行單克隆/混合克隆分離培養后測序驗證，可以篩選出目的基因有效敲除的單克隆細胞株進行后續科研實驗。
二、方案流程
圖1 實驗評估及操作流程圖
三、結果展示
1.將sgRNA克隆至表達質粒并轉染293T細胞，72h后分選陽性細胞，抽提基因組DNA，進行T7E1檢測，篩選切割效率最高的5’sgRNA-3用于后續質粒構建。
圖2 sgRNA切割活性驗證
2.通過熒光標簽將陽性細胞分選至96孔板中進行單克隆培養。
圖3 流式分選陽性細胞
3.單克隆株PCR鑒定：針對目的基因序列設計基因型鑒定引物，正反向引物設計在敲除片段兩端，Control組通過PCR能夠擴增出1065bp的片段,基因敲除組通過PCR能夠擴增出219bp的片段。
4.將PCR鑒定正確的樣品進一步進行測序鑒定
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