高靈敏度支原體qPCR檢測試劑盒說明書(探針法）

【產品規格】

BPMPro100  100 Reactions/盒

【產品說明】

支原體(Mycoplasma)：目前發現的最小原核生物，據統計約15~35% 的細胞被支原體污染。支原體污染會改變宿主細胞的結構與功能，易致實驗結果不穩定，須對培養細胞定期進行支原體檢測。

本試劑盒采用多套引物探針在FAM通道檢測支原體DNA，采用一套引物探針在HEX通道檢測內參DNA，檢測對象為細胞培養的上清液，細胞沉淀或其他生物制品。該試劑盒具有以下特點：

靈敏：配合推薦使用的核酸抽提方案，檢測靈敏度達到10CFU/mL。

可靠：抽提加入內標核酸，全過程質量控制。

穩定：全程閉管操作，無交叉污染。

方便：操作簡單，無需電泳步驟。

【有效期】

規定儲存條件下6個月。

-20 ℃取出后，可避光存放于4 ℃繼續使用1周。

【產品組分】

表1   產品組分

注：

1、陽性質控含有支原體DNA和內標DNA。

2、內部質控含有內標DNA。

在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意事項和無菌操作規范！

【操作步驟】

1.樣本制備

（1） 樣本的標準制備方案：請配合使用高效無微生物污染的DNA抽提試劑盒提取樣本DNA。整個過程需要遵守無菌操作規范。本公司目前推薦抽提試劑盒見附錄3。直接取20 µL待測樣本DNA，作為模板進行 qPCR 反應。

（2） 前處理陰性樣本準備方案：將RNase Free Water當成樣本，加入內部質控，進行核酸抽提。

1. qPCR 反應液的準備

（1） 根據所要檢測樣品的數量，計算所需反應孔數，每個樣本做3個重復孔。

反應孔數=1個陽性PCR質控+1個陰性PCR質控+1個前處理陰性質控+樣本數× 3

（2） 根據反應孔數計算所需的qPCR Mix 總量（需有1孔的加樣損失量）：

  Mix =（反應孔數+1）×10 μL

（3） 各試劑放室溫融化，并根據下表所示準備 qPCR Mix：

表2  qPCR Mix的配制

2. 加樣

（1）震蕩混勻 qPCR Mix，低速離心，將管蓋殘留液體收集至管底。

（2）向每孔反應管中分裝 10 μL qPCR Mix。

（3）向已分裝過 qPCR Mix 的反應管中加入15 μL石蠟油。

（4）向反應管中加入樣品后短暫離心，加樣示例如下：

表 3 加樣示例   

【注】：此時每個反應孔的體積為30 μL。

qPCR 陰性的PCR模板為20 μL RNase Free Water。

PCR 儀設置以 ABI 7500 為例，相對定量模式，選擇TaqMan 探針法：

注：1、該程序為兩階段擴增法，如熒光定量PCR儀可以兩階段收集熒光，按照正常Ct值判斷結果；如果只能最后一步收集熒光，需要在原數據的基礎上加15個Ct值。

2、ROX設置是以7500為例，但也存在例外，例如StepOne。

【閾值設置】

以ABI 7500 為例，擴增曲線選擇 log 法，如果不能兩階段收集熒光，基線設置1~2個循環；如果可以，基線設置3-15個循環。建議用 log 法擴增曲線保證結果穩定可靠。

（1） 內參(HEX/VIC)閾值設定：以陽性對照定內參擴增曲線閾值，將內參的Ct 值定為 28±2。

（2） 支原體(FAM)閾值設定：以陽性對照定支原體擴增曲線閾值，將支原體(FAM)的 Ct 值定為 28±2 。

【實驗質量控制】：

如果陽性對照管的支原體(FAM)Ct 值>30，但陽性對照管及前處理陰性對照管的內參(HEX)Ct 值正常，表明陽性支原體對照模板有降解。

如果樣品前處理陰性的內參（HEX/VIC)Ct 值>30，陽性對照管的內參(HEX)Ct 值>30 ，表明內參DNA存在降解或PCR體系擴增效率下降。

【結果判讀】

根據支原體(FAM) Ct 值、內標(VIC) Ct 值判定，具體標準如下：

要求每個檢測樣品做3重復，如果3復孔中，兩重復為陽性，則判讀為陽性；建議做樣本前處理陰性，可以質控整個抽提過程。

注：檢測結果異常時：

1. 樣品前處理陰性：內參Ct值過大，表明抽提效率低；支原體檢測通道Ct值小于37.5，可能前處理抽提過程存在污染。

2. qPCR陰性：支原體和內參檢測通道Ct值小于37.5，操作過程存在污染。

3. 樣本前處理陰性質控和PCR陽性質控內參差1±1個Ct值屬于正?，F象。

【 PCR過程注意事項】

由于 PCR 反應非常靈敏，實驗操作中應注意以下事項，以免發生DNA 污染：

1．試劑盒開啟后，陽性質控和內部質控與試劑Biowing® MyqPCR Reaction Mix1、Biowing®MyPrimer&Probe Mix2、RNase Free Water、石蠟油分開存放。

2．每個組分在使用前都應先低速離心后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起泡，并低速短暫離心后使用。

3．要求核酸抽提和qPCR過程都符合無菌操作規范。

4．建議自備轉運盒，用于將配制分裝好的Mix從配置Mix超凈工作臺轉運到加樣超凈工作臺。

5．建議在 qPCR 反應板上陽性對照的排布應遠離待測樣本和陰性對照。

6．建議 qPCR 配置與分裝在一個無菌操作臺，樣本的加樣在另外一個無菌操作臺。

7．建議使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣。

8．應按照先加陰性，再加樣本，最后加陽性的順序加樣。且陽性用專門的加樣器。建議陽性在專門的無菌操作臺加樣。

9．qPCR 反應板封膜或蓋蓋子時須反復壓緊。

10．上機擴增前，反應管短時低速離心，將管壁液體收集至管底

11．蓋上反應管蓋子或者貼上光學膜后，為避免影響熒光信號讀取，請注意不要在管蓋或者膜上做標記，或者用刮板反復摩擦。

12．本產品僅作科研用途。

【附錄 1 可檢測支原體種類】

【附錄 2 適用熒光定量 PCR 儀品牌型號】

注：適用熒光定量PCR 儀為迄今為止我們客戶配備的定量儀器品牌型號，如您的熒光定量 PCR 儀不在我們列出的范圍，也歡迎聯系我們，申請試用。

如有技術問題，歡迎電話咨詢：021-33559491

【附錄 3 樣本前處理和抽提方案】

為了檢測靈敏度達到10CFU/mL，起始量為2mL及以上。

在實驗前請完整閱讀本說明書，務必重視注意點！

樣本前處理

實驗準備

陰性對照（NCS）：每次實驗中都需要用稀釋液設置一個 NCS 作為對照樣品，NCS 與其他待測樣品一起進行 DNA 的提取和純化操作，以評估在樣品處理過程中各操作步驟是否正確，是否存在樣品交叉污染或環境污染的情況。

制備步驟如下：取 1.5 mL 無菌低吸附離心管，加入無菌水（具體根據抽提方案調整），再加入6 μLIC，混勻。

待測樣品：在提取支原體樣品之前將 IC 添加到樣品中，可以作為整個實驗過程的質控。制備步驟如下：取 1.5 mL 無菌低吸附離心管，根據不同抽提方案上樣量調整離心濃縮后體積，再加入 6 μL IC，混勻。

樣品處理

離心濃縮

• 取離心去除細胞后的上清，于  4 ℃ 15000 rpm 離心  10      min，沉淀支原體顆粒。

• 離心后，小心用移液槍緩慢吸出上清。注意吸取速度不可太快，槍頭不可觸碰支原體沉淀顆粒。切忌采用直接傾倒的方式去除上清，以免造成損失。

• 加入裂解液（具體根據抽提方案調整），用移液槍吹打或渦旋重懸支原體沉淀，并輕微離心， 將管壁等上面的液滴離心下來。

注意樣品預處理好后需盡快進行下述的DNA 提取實驗

抽提方案

樣品可手工抽提，也可機器抽提。已測試過的手工抽提試劑盒、機器抽提試劑盒和配套儀器具體貨號和型號如下：

手工抽提：

1）QIAGEN公司的QIAamp UCP Pathogen Mini Kit (50)，貨號： 50214；抽提上樣量400 uL。

2）天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒（50 preps），貨號：DP302；抽提上樣量200 uL。

機器抽提：

1）濟凡公司的FineQuick 快速磁珠法大體積血液基因組提取試劑盒（48次），貨號：M104T，機器型號：Purifier HT；抽提上樣量2mL。

2）Genolution公司的NX Bacterial DNA Kit，貨號：CBD296，機器型號：NX-48；抽提上樣量200 uL。

核酸抽提注意事項

Ø 請盡量在完成樣品純化處理當天進行后續的 DNA 檢測，以保證檢測結果的準確性。

Ø 請離心濃縮完馬上開始DNA抽提，以保證檢測結果的準確性。

Ø 手抽提取純化操作過程建議在二級生物安全實驗室或安全柜中進行。

手抽樣品制備期間:

Ø 小心地將樣品溶液加到核酸吸附柱上。槍頭中的樣品進入核酸吸附柱而不濕潤柱的邊緣。

Ø 不同液體在轉移之間更換槍頭。使用帶濾芯的槍頭。

Ø 避免用槍頭接觸核酸吸附膜。

【附錄 4 相關設備耗材】

實驗所需但試劑盒中未含材料

Ø RNase Free Water

Ø 無水乙醇（分析純）

Ø PCR 8 連管或 96 孔板，相應管蓋或覆膜

Ø 1000μL，100μL，10μL 無菌低吸附濾芯槍頭

Ø 1.5mL，2mL 無菌低吸附離心管

相關設備

Ø 迷你離心機

Ø 漩渦振蕩器

Ø 恒溫水浴鍋或金屬浴鍋

Ø 1000μL，100μL，10μL 移液槍

Ø 熒光定量 PCR 儀

Ø 生物安全柜

Ø 冷凍離心機

Ø 微孔板迷你離心機

【附錄 5 無菌操作規范】

無菌操作規范

1、除高速離心機外，其他設備和耗材應放在無菌操作臺中，保證無菌。

2、樣本高速離心后，要對離心管噴酒精，并用棉球擦拭離心管外壁，同時更換干凈的板架和新手套。

3、實驗前用75%酒精擦凈臺面及四周，放好需用的實驗器材及各種溶液，并用酒精棉球擦拭，更換干凈的管架。

4、對著桌面，空間噴灑酒精，然后將超凈工作臺通風機打開，超凈工作臺和紫外燈打開 30～45 分鐘，再將無菌室紫外燈打開 30～45 分鐘后關閉，再通風 15 分鐘。關閉紫外，拉開小一半隔離，用酒精棉球擦拭超凈工作臺桌面2遍，關上隔離。

5、進入無菌室操作前，雙手在操作臺內手臂部分用75%的酒精擦拭消毒。穿專用工作服、帽及拖鞋、口罩，應放在無菌室緩沖間，工作前經紫外線消毒后使用。

6、無菌室溫度宜控制在 18～28℃，濕度在 45%～65%（溫濕度計應該用無水的）。

7、從槍頭盒中取出槍頭時，尖部不能觸及外露部位及離心管和管架邊。

8、操作盡量在酒精燈前操作。打開離心管前，酒精燈灼燒鑷子，待冷卻后用鑷子開關管蓋。

9、操作中，不能在樣品上方翻轉瓶蓋，袖口不能掠過樣品上方。

10、實驗完畢，清潔臺面。

11、實驗者在實驗后用肥皂清洗雙手。

12、換下的專用實驗服，進行紫外線，一次性鞋套額帽子扔進垃圾桶。

13、用畢，再開紫外燈消毒 30分鐘。

14、無菌室和緩沖間定期大掃除，保持整潔。

15、定期檢查紫外燈燈管。每隔兩周需用酒精棉球輕輕擦拭，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響。如燈管發黑，超過使用期限，及時更換紫外燈管。

2、注意事項

(1)工作臺面上，禁止存放不必要的物品，以保證工作區域內的潔凈氣流不受干擾。

(2)禁止在工作臺面上記錄，工作時應盡量避免作明顯擾亂氣流的動作。(3)根據環境潔凈度，每 3~6 個月將中效過濾器中的濾料拆下清洗。一般情況下，當無紡布濾料容納塵埃較多、表面發黑時即可拆下進行清洗，或者予以更換。

(4)風機轉速調至最大時，仍不能達到所需要的風速時（即風速≤0.2m/s）,則必須更換高效空氣過濾器。