注意事項：

1.?????? 質?？截悢? 純化中低拷貝的質粒時，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1, B1, N3, RET, 100% ethonal 相同體積的DNA Wash Buffer和Endofree Elution Buffer.

2.?????? 轉化菌: 若為-70^oC甘油凍存的菌，請先涂布平板培養后，再重新挑選新的單個菌落進行培養。

3.?????? 切勿直接取凍存的菌進行培養。

操作簡要步驟：

1.?? 取100 μL新鮮的菌液接種到150-200 mL (勿超過 200 mL)的LB培養基（含適量抗生素），37^oC震蕩培養14-16小時。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。

2.?? 加入10 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保細菌沉淀重新懸浮。

3.?? 加入 10 mL Buffer B1, 輕輕地反轉5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。?

4.?? 加入3 mL Buffer N3, 立即反轉5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時出現白色絮狀沉淀。

5.?? 將離心管轉至高速離心機，在室溫下12,000 x g離心10分鐘（若上清中有白色沉淀，可再次離心）。

6.?? 轉移上清液20 mL（不超過20 mL）至新的50mL離心管中，加入0.5倍體積的Buffer RET (即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET) 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過DNA柱。

7.?? 立即轉移20 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。將剩余溶液轉移至DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復直至所有的溶液通過DNA柱。

8.?? 可選：向離心柱中加入10 mL Buffer KB，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。

9.?? 向離心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復步驟“9”。

10.????? 將離心柱放回高速離心機中，室溫下5,000 x g開蓋離心10分鐘，以徹底去除殘留的乙醇。

11.????? 將離心柱轉至一個新的50 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘，以洗脫質粒DNA。將50 mL離心管中的洗脫液上柱再放置洗脫1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘。 兩次洗脫將提高得率。