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雙螢光素酶報告基因檢測（啟動子活性）實驗

摘要：通過雙螢光素酶報告基因系統檢測轉錄因子steroidogenic factor-1（SF-1）能否與Oct-4啟動子片段 (4kb) 發生作用。實驗結果顯示二者存在調控關系。
關鍵詞：steroidogenic factor-1（SF-1），Oct-4 promoter，transcription factors，Dual-Reporter Assay

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一、?實驗原理
轉錄因子是一種具有特殊結構、行使調控基因表達功能的蛋白質分子，也稱為反式作用因子。某些轉錄因子僅與其靶啟動子中的特異序列結合，這些特異性的序列被稱為順式因子，轉錄因子的DNA結合域和順式因子實現共價結合，從而對基因的表達起抑制或增強的作用。螢光素酶報告基因實驗（luciferase Assay）是檢測這類轉錄因子和其靶啟動子中的特異順序結合的重要手段，其原理簡述如下：（1）用靶啟動子的特定片段替換報告基因質粒（如pGL3-basic）的啟動子區。（2） 將要檢測的轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉。如果該轉錄因子能夠激活靶啟動子，則螢光素酶就會表達，且其表達量與轉錄因子的作用強度成正比。（3） 加入特定的底物，螢光素酶與底物反應，產生螢光素，檢測熒光的強度可以對螢光素酶的活性定量，進而判斷該轉錄因子能否與靶啟動子片段發生作用 （及其作用強度）。

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二、?實驗目的
驗證轉錄因子SF-1能否與Oct-4啟動子片段發生作用。

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三、?實驗步驟
1.?質粒轉染細胞：
1)?細胞鋪板：將細胞按70%的匯合度接種到96孔板。
2)?轉染：16h后轉染螢光素酶報告基因質粒和RNA，每個樣品設置6個復孔。
a)?配制DNA和轉染試劑: 96孔板轉染質粒時每孔比例為pLenti：Firefly：Renilla：轉染試劑=0.2μg：0.1μg：0.01μg：0.25μl。
b)?稀釋好DNA及轉染試劑，常溫孵育5min。
c)?將稀釋好的DNA分別和轉染試劑混勻，常溫孵育20min。
d)?每孔棄去15μl培養基，將15μl DNA轉染混合液添加到每孔細胞樣品中。
e)?轉染6h后，換新鮮完全培養基。
2.?雙報告基因檢測：
a)?質粒共轉染48h后，棄去培養基，用100μl 1XPBS洗1遍。
b)?傾斜96孔板，吸干剩余的PBS。
c)?去離子水將5XPLB稀釋成1XPLB，使用前放到常溫。
d)?每孔加50μl稀釋好的 1X PLB，搖床常溫條件下搖15min，進行裂解。
e)?白色不透光的96孔酶標板中每孔加步驟4的上清液10μl，加入100μl預先混好的LAR II，2s后測數據。
f)?每孔添加100μl預先混好的Stop&Glo Reagent，靜止2s后，測數據。
注意：進行Luciferase活性檢測時，需在避光條件下進行。

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四、?實驗結果

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表1. 空白校準后的數據：

Firefly luciferase的數據除以Renialla luciferase的數據，用平均值做圖。
p值的計算方法為雙側student-T-test。P值判斷兩組數據的差異是否顯著。

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圖1.SF-1調控Oct-4啟動子區
***表示p<0.001
結論：從圖1的結果可以看到，在SF-1過表達的情況下，Oct-4啟動子活性相對對照組明顯升高（p<0.001）。

五、?參考文獻
1.?Yang HM, Do HJ, Kim DK, Park JK, Chang WK, Chung HM, Choi SY, Kim JH.Transcriptional regulation of human Oct-4 by steroidogenic factor-1.J Cell Biochem. 2007;101(5):1198-1209.
2.?Lorenz WW, McCann RO, Longiaru M, Cormier MJ.Isolation and expression of a cDNA encoding Renilla reniformis luciferase.Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 15;88(10):4438-42.
3.?Farr A, Roman A. pitfall of using a second plasmid to determine transfection efficiency.Nucleic Acids Res. 1992 Feb 25;20(4):920.
4.?Sherf, B.A. et al. Dual-Luciferase? reporter assay: An advanced co-reporter technology integrating firefly and Renilla luciferase assays. 1996 Promega Notes 57, 2-9.

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