產品簡介

乳酸脫氫酶細胞毒性檢測試劑盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit), 也被稱為乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒(LDH Release Assay Kit) ，主要用于檢測樣品中 LDH 含量。

LDH（乳酸脫氫酶）是一種廣泛存在于各類生物體中較為穩定的胞漿酶，細胞狀態正常時不能通過細胞膜， 當細胞受損或死亡時可釋放到細胞外。釋放到培養基上清中的 LDH 可通過偶聯酶反應來定量檢測。在 LDH  的作用下，NAD+被還原生成 NADH，NADH 和 INT（2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride） 被硫辛酰胺脫氫酶（Diaphorase）催化反應生成 NAD+和紅色的甲臜(Formazan） ，甲臜的量與裂解（死  亡）細胞的數量成正比，在 490nm 波長下產生吸收峰，因此可通過吸光度檢測來判斷樣品中 LDH 的活性。 本試劑盒可檢測細胞培養液、細胞裂解液等樣品中 LDH 的活性。一個試劑盒可進行 500 次檢測。

組分信息

儲存條件

冰袋運輸。-20℃保存 ，1 年有效。其中酶溶液避免反復凍融 ，INT 溶液(10×)需避光保存。

注意事項

1.      建議樣品準備好后盡量當天完成檢測。冷凍會使樣品中部分乳酸脫氫酶失活 ，4℃可放置 2-3 天。

2.     由于血清中含有乳酸脫氫酶 ，建議血清的使用濃度不要超過 1% ，并最好使用熱滅活血清。如果一定  需要使用 10%血清 ，在檢測時務必設置沒有細胞但加入了相同體積培養液的對照孔 ，用于消除背景。

3.     細胞過度生長、密度過高、離心速度過大、培養箱內外溫差大 ，都會造成細胞釋放乳酸脫氫酶增加。

4.     如果希望進行乳酸脫氫酶活性的絕對定量 ，需自備乳酸脫氫酶標準品。

5.     操作過程中要避免氣泡的出現 ，氣泡會影響吸光值讀數。

6.     吸取細胞時需溫和操作 ，力度過大會造成自發性 LDH 釋放 ，影響結果。

7.     為了您的安全和健康 ，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

8.     本產品僅用于科研。

使用說明

1.     樣品準備：

1.1   LDH 釋放檢測

       1)     根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到 96 孔細胞培養板中 ，使待測時細胞密度不超 80-90%。

2)     吸去培養液 ，用 PBS 洗滌一次。更換新鮮培養液(推薦使用含 1%血清的低血清培養液或適當的無血     清培養液)，將各培養孔分成如下幾組：無細胞的培養液孔(背景空白對照孔)，未經藥物處理的對照細   胞孔(樣品對照孔) ，未經藥物處理的用于后續裂解的細胞孔(樣品最大酶活性對照孔) ，以及藥物處理     的細胞孔(藥物處理樣品孔) ，并做好標記。按照實驗需要給予適當藥物處理(如加入 0-10 μL 左右特定   的藥物刺激 ，可設置不同濃度 ，不同處理時間 ，對照孔中需加入適當的藥物溶劑對照) ，繼續常規培     養。到預定的檢測時間點前 1 小時 ，從細胞培養箱里取出細胞培養板 ，在“樣品最大酶活性對照孔” 中加入試劑盒提供的細胞裂解液，加入量為原有培養液體積的 10%。加入細胞裂解液后，反復吹打數   次混勻 ，然后繼續在細胞培養箱中孵育。

3)     到達預定時間后，將細胞培養板用多孔板離心機 400 g 離心 5 min。分別取各孔的上清液 120 μL，加 入到一新的 96 孔板相應孔中 ，隨即進行樣品測定。

1.2   細胞內總 LDH 的檢測

1)     細胞毒性檢測：根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到 96 孔細胞培養孔板中 ，使待檢測時細 胞密度不超過 80-90%。加入不同藥物進行處理 ，并設置適當對照。藥物刺激完畢后 ，將細胞培養板 用多孔板離心機 400 g 離心 5 min。盡量吸除上清 ，加入 150  μL 用 PBS 稀釋 10 倍的試劑盒提供的 細胞裂解液(10 體積 PBS 中加入 1 體積細胞裂解液并混勻) ，適當搖晃培養板混勻 ，然后繼續在細胞 培養箱中孵育 1 小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機 400 g 離心 5 min。分別取各孔的上清液 120 μL ，加入到一新的 96 孔板相應孔中 ，隨即進行樣品測定。

2)    細胞增殖檢測：根據細胞的大小和生長速度將適量細胞接種到 96 孔細胞培養孔板中 ，使促進細胞增 殖的藥物刺激后細胞不超過 80-90%為宜。使用不同的藥物刺激細胞 ，并設置適當對照。藥物刺激完 畢后 ，將細胞培養板用多孔板離心機 400g 離心 5 min。盡量吸除上清 ，加入 150  μL 用 PBS 稀釋了

10 倍的試劑盒提供的細胞裂解液(10 體積 PBS 中加入 1 體積細胞裂解液并混勻) ，適當搖晃混勻 ，然 后繼續在細胞培養箱中孵育 1 小時。隨后將細胞培養板用多孔板離心機 400 g 離心 5 min。分別取各 孔上清液 120  μL ，加入到一新的 96 孔板相應孔中 ，隨即進行樣品測定。

【注】 ：LDH 釋放檢測更為常用 ，細胞內總 LDH 檢測通?？梢杂?nbsp;MTT、WST-1 或 CCK-8 等方法替代。

2.     試劑盒的準備工作：

1)     INT 溶液(1×)的配置：根據所需的 INT 溶液(1×)的量，取適量 INT 溶液(10×)用 INT 稀釋液稀釋至 1  ×。例如 ，取 20  μL INT 溶液(10×) ，加入 180  μL INT 稀釋液 ，混勻后即為 200  μL INT 溶液(1×)。 INT 溶液(1×)宜現配現用 ，配置后 4℃保存可于當天使用 ，不宜配置后凍存。

2)     LDH 檢測工作液的配制：根據待測定的樣品數(含對照) ，參考下表在臨檢測前新鮮配制適量的檢測工 作液?！咀ⅰ?nbsp;：LDH 檢測工作液必須現配現用 ，配制和使用過程中均要注意適當避光。

      3)     （選做）如果希望進行 LDH 酶活性的絕對定量 ，需自備 LDH 標準品 ，并新鮮配制不同濃度 LDH 標

準品 ，如 10 mU/mL、 5 mU/mL、2.5 mU/mL、1.25 mU/mL、0.65 mU/mL、0 mU/mL。

3.     樣品測定：

      1)     各孔分別加入 60  μL LDH 檢測工作液。

2)     混勻 ，室溫(約 25℃)  避光孵育 30 min(可用鋁箔包裹后置于水平搖床或側擺搖床上緩慢搖動)。然后  在 490 nm 處測定吸光度?？墒褂?600 nm 或大于 600 nm 的任一波長作為參考波長進行雙波長測定。

      3)     計算(測得的各組吸光度均應減去背景空白對照孔吸光度)

細胞毒性或死亡率(%)=(處理樣品吸光度－ 樣品對照孔吸光度) / (細胞最大酶活性的吸光度－ 樣品對照 孔吸光度)×100

4)     可繪制細胞毒性曲線：縱坐標為實際吸光度，橫坐標為藥物濃度；據此可計算該藥物作用特定時間的 半致死劑量 LD50。

【附 1   LDH 酶活性的相對定量】：

可同時測定一已知濃度的 LDH 酶標準品對應的吸光度值 ，參考以下公式粗略計算出樣品中 LDH 酶活力：

待測樣品中 LDH 活力單位(mU/mL) ＝(樣品孔 OD490－背景空白對照孔 OD490) / (標準管 OD490－標準空白管

OD490)×標準品濃度(mU/mL)；根據計算結果可以比較不同樣品處理組間有無統計學差異等。

【附 2  LDH 酶活性的絕對定量】：

若需準確計算出 LDH 酶活性的絕對活性 ，可通過一系列 LDH 標準品及相應測得的吸光度值繪制標準曲線, 通過標準曲線相應公式計算出樣品中 LDH 的酶活性。

各孔數值減去空白對照后 ，以檢測的吸光度(OD490)為縱坐標 ，LDH 酶活力(mU)為橫坐標 ，繪制 LDH 標準 曲線。同時計算出該趨勢線的公式。

A490nm ＝k×LDH 酶活力單位(mU)＋b ，通過 Excel 等軟件計算出趨勢線的斜率 k 和截距 b。