產品介紹：

BrdU?作為一種胸腺嘧啶核苷的類似物（其化學結構特點是胸腺嘧啶的堿基嘧啶環上與5位C 原子連接的甲基被溴代替），像胸腺嘧啶核苷一樣可摻入到細胞合成的DNA 中。當細胞處于DNA 合成期（S 期）,在培養基中加入BrdU,其就會摻入新合成的DNA中，這種BrdU 就在胞核的DNA 中長期存留；再通過HRP標記的BrdU單克隆抗體，就可以通過TMB底物顯色檢測細胞增殖和活力情況。這種方法的缺點是；實驗步驟繁瑣，并且在加入抗體之前，要充分變性DNA，才能使BrdU單克隆抗體順利結合到摻入BrdU的DNA上，同時破環了其DNA雙鏈結構，影響其他染料的結合。如果變性不充分，實驗很容易失敗。

本試劑盒所用的核酸類似物為EdU,其摻入新合成DNA的原理和過程BrdU相同；EdU的集團上還有一個炔基團，與下游的熒光染料上的疊氮基團，在一價銅離子催化下，發生Click chemistry反應，也就是大家翻譯成中文的點擊化學。本方法與BrdU相比的主要優勢是操作的流程更簡單，并且EdU分子只有抗體分子的1/500，不需要DNA的變性步驟；從效果上來說，EdU比BrdU有更好的靈敏度和準確度。

注意事項：

熒光試劑很容易淬滅，因此實驗過程中盡可能選擇早期時間觀察記錄結果，同時注意避光，以減緩淬滅；

為了您的安全，實驗過程中請注意佩戴手套。

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其他需要自備試劑材料：

??1×PBS（pH 7.2-7.6）

? 細胞固定液（含 3.7%甲醛的 PBS）

? 細胞透膜液（含 0.5% Triton? X-100 的 PBS）

?????1×Hoechst 33342 染色液

? 含 3% BSA 的 PBS（pH 7.4）

? 去離子水

? 18×18 mm 蓋玻片

各種規格吸頭及移液細胞培養耗材。

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試劑盒儲存：

2-8°C,避光，干燥，不要凍存。。

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試劑盒操作流程圖：

細胞爬片制備（細胞鋪板培養）→細胞處理（可選）→EdU與細胞共培養→細胞固定及細胞膜透化處理→檢測EdU（click chemistry）→抗體或者其他染料染色→圖像捕獲及分析

具體使用操作方法：

1.???EdU的標記

正式實驗前，最好做預實驗，以確定最佳的標記濃度,因為細胞類型，細胞密度，細胞培養基及培養條件不同，最佳包被濃度也不盡相同。預實驗的時候，建議從10uM的濃度做幾個濃度的梯度來確定最佳使用濃度。

1.1將洗凈滅菌的蓋玻片放入細胞培養板孔，將合適濃度的細胞鋪到蓋玻片上，待細胞貼壁及正常生長到合適的密度；

1.2?將EdU溶液用培養基稀釋到20 μM EdU?初始濃度，使用的時候，加入與細胞培養液相同體積的以上工作液；例如實驗時，細胞培養液為200ul,吸去100ul培養液，然后加入100ul EdU溶液即可；

1.3細胞重新放入培養箱培養，培養的時間長度和培養條件是根據細胞類型確定的，確切的說就是根據細胞生長速度和周期確定的。

以下信息僅供參考：人胚胎細胞細胞周期約30分鐘，EdU培養?5-10分鐘；人的神經細胞周期是5天，EdU培養?24小時；人的其他細胞一般生長周期20小時左右，EdU培養?2小時左右。

2.???細胞固定及膜透化處理

吸干細胞培養液，將含有細胞爬片的板孔內加入1ml細胞固定液（含3.7%甲醛的PBS）室溫固定細胞15分鐘

吸干細胞固定液，每孔用1ml洗滌液(含3% BSA的PBS)浸泡5分鐘；

吸干細胞清洗液，每孔加入1ml細胞膜透化液（含0.5%的TritonX-100）,室溫進行膜透化處理20分鐘。

3.???EdU的檢測

3.1?10XEdU檢測液的配制，將試劑EdU管內加入1ml去離子水，即為10XEdU檢測液，使用后及時存放在-20℃，可以穩定保存1年。

3.2?EdU檢測工作液配制：用去離子水將10XEdU檢測液稀釋10倍，即為EdU檢測工作液（比如，需要1mlEdU檢測工作液,取10XEdU檢測液100ul,加入900ul去離子水，混勻即可），現配現用，不可儲存備用。

3.3?EdU檢測反應體系配置，參照下表配制，現配現用，存儲不超過20分鐘。

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EdU檢測反應體系參考表(各組分體積單位：ul)

試劑組分

蓋玻片數量

5

10

Reaction Buffer

430

860

CuSO4

20

40

Flour azide

1.5

3

EdU檢測工作液

50

100

總體積

500

1000

3.4??配制EdU檢測反應體系的同時，立即吸干細胞膜透化液，每孔加入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復一次；

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3.5?吸干清洗液，每孔加入100ul EdU檢測反應液，

3.6?室溫避光反應30分鐘

3.7吸干EdU檢測反應液，入1ml含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復1-2次。

某些細胞貼壁能力較強，背景會偏高，可以使用甲醇清洗1-2次，再用含3% BSA的PBS浸泡清洗5分鐘，重復1-2次。

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4.???染色細胞核（如果需要）

推薦選用 1×Hoechst 33342進行DNA染色

染色的步驟如下：

4.1?每孔加入?1 ml PBS?浸泡清洗細胞，吸干細胞清洗液。

4.2?配制1×Hoechst 33342?染色液。

4.3?每孔加入?200 μl 1×Hoechst 33342?染色液。室溫孵育?15?分鐘，注意避光。吸干?Hoechst 33342?染色液。

4.4?每孔加入?1 ml PBS?浸泡清洗細胞?5?分鐘，重復一次。吸干PBS。

5.???5.?成像及分析

將細胞爬片晾干，封片，選擇合適的波長在熒光顯微鏡下觀察并記錄圖像。