MSC無血清培養(yǎng)基
產(chǎn)品名稱： MSC無血清培養(yǎng)基
英文名稱： MSC NutriStem® XF Medium
產(chǎn)品編號(hào)： 05-200-1，05-201-1
產(chǎn)品價(jià)格： 0
產(chǎn)品產(chǎn)地： 以色列
品牌商標(biāo)： Biological industries（BI）
更新時(shí)間： null
使用范圍： null
- 聯(lián)系人 : 市場(chǎng)部
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- 郵編 : 200120
- 所在區(qū)域 : 上海
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間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基
MSC NutriStem??XF Medium
產(chǎn)品說明書：
一、目的：利用間充質(zhì)干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。
二、材料：新生兒臍帶
三、主要儀器：醫(yī)用手術(shù)器械，生物安全柜，CO2培養(yǎng)箱，6孔培養(yǎng)板，T25培養(yǎng)瓶
四、試劑：
表1 MSC NutriStem??XF Medium
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用途 |
品牌 |
貨號(hào) |
名稱 |
規(guī)格 |
保存條件 |
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MSC培養(yǎng)基 |
Biological?Industries |
05-200-1A |
MSC NutriStem??XF Basal Medium MSC無血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基 |
500ml |
4℃ |
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Biological?Industries |
05-201-1U |
MSC NutriStem??XF Supplement MSC無血清添加劑 |
3ml |
-20℃ |
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細(xì)胞貼壁 |
Biological?Industries |
05-752-1H |
MSC Attachment solution (100X) MSC貼壁試劑 |
1 ml |
4℃ |
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Biological?Industries |
05-760-1-15 |
NutriCoat? Attachment solution (500X)? NutriCoat?貼壁試劑 |
1.5ml |
RT |
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? Biological?Industries |
PLTGOLD010R |
PLTGold??Human Platelet Lysate 血小板裂解物** |
10ml | -20℃ | |
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**已知血小板裂解物含有大量的外泌體，用戶可依照實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x用合適的貼壁試劑。 |
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細(xì)胞傳代 |
Biological Industries |
03-079-1A |
Recombinant Trypsin-EDTA Solution 重組胰酶-EDTA |
500ml |
RT |
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Biological?Industries |
03-048-1C |
Soybean Trypsin Inhibitor (50X) 大豆胰酶抑制劑 |
20 ml |
-20℃ |
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Biological?Industries |
02-023-1A |
DPBS (w/o Ca & Mg) |
500 ml |
RT |
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DPBS緩沖液 |
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輔助試劑 |
Biological?Industries |
05-713-1B |
NutriFreez?? D10 Cryopreservation Medium |
100 ml |
4℃ |
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D10?凍存液 |
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Biological?Industries |
03-031-1B |
Penicillin-Streptomycin Solution (100X)青鏈雙抗 |
100ml |
-20℃ |
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| ? | Vivacell | C35010010 |
MSC ACF Tissue Digestive Mix 高效原代干細(xì)胞分離液 |
100m | -20℃ |
五、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
5.1完全培養(yǎng)基的準(zhǔn)備
5.1.1凍存的MSC NutriStem??XF Supplement在室溫或2-8℃解凍，避免反復(fù)凍融。
5.1.2配制：MSC NutriStem??XF Basal Medium（培養(yǎng)基）：MSC?NutriStem??XF Supplement（添加物）：青鏈雙抗=500ml：3ml：5ml，4℃保存，2周內(nèi)使用。
注1：雙抗非必須，建議原代（P0）時(shí)使用。
注2：培養(yǎng)基含L-Glutamine，貯藏時(shí)避免長(zhǎng)期照光。
?
5.2包被培養(yǎng)皿
或跳過此步驟，直接加2%血小板裂解物，促進(jìn)MSC細(xì)胞貼壁與生長(zhǎng)。
如果使用05-752-1H，參考如下步驟：
5.2.1使用DPBS溶液（BI, Cat# 02-023-1A），將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。
5.2.2參照表3，加入適量的1X MSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。
表3? 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-752-1）
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培養(yǎng)器皿 |
表面積cm2/孔或瓶 |
1X MSC貼壁試劑使用體積 |
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96孔板 |
0.34 |
0.05~0.1 ml |
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24孔板 |
1.9 |
0.2~0.4 ml |
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12孔板 |
3.9 |
0.4~0.8 ml |
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6孔板/ 35 cm培養(yǎng)皿 |
9.6 |
1~2 ml |
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T25瓶/ 60 cm培養(yǎng)皿 |
25 |
2.5~5 ml |
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T75瓶 |
75 |
7.5~15 ml |
?
注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。（標(biāo)示紅色為原廠建議使用量，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)試后可減半使用）
注2：包被期間， 注意包被液不可以干掉！
?
5.2.3輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。
5.2.4在2-8℃孵育過夜；或者在CO2培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育30分鐘。
5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。
?
如果使用05-760-1-15，參考如下步驟：
5.2.1使用生理鹽水，將NutriCoat? 促貼壁試劑稀釋500倍（1:500）。
5.2.2參照表4，加入適量的1X NutriCoat? 促貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板。
表4? 涂層過程中貼壁試劑建議使用量（05-760-1-15）
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培養(yǎng)器皿 |
表面積cm2/孔或瓶 |
1X?NutriCoat? 促貼壁試劑使用體積 |
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96孔板 |
0.34 |
0.1 ml |
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24孔板 |
1.9 |
0.5 ml |
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12孔板 |
3.9 |
1 ml |
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6孔板 |
9.6 |
2.5 ml |
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T25瓶 |
25 |
6.5 ml |
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T75瓶 |
75 |
19 ml |
注1：涂層的培養(yǎng)皿需在無菌條件下2℃-8℃儲(chǔ)存，需在一周內(nèi)使用。
注2：包被期間，注意包被液不可以干掉！
5.2.3輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布在培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。
5.2.4在2-8℃孵育過夜；或者在CO2培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育1小時(shí)。
5.2.5接種前, 吸除貼壁試劑，用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿（或不需要清洗），即可接種細(xì)胞。
5.3制備1X大豆胰酶抑制劑
5.3.1使用無菌的DPBS，將50X大豆胰酶抑制劑（03-048-1C）稀釋成1X。
注1：抑制重組胰酶消化建議方法：第一種使用大豆胰酶抑制劑；第二種使用PBS/DPBS清洗（2倍重組胰酶量）吹打,?離心去上清；第三種使用維持培養(yǎng)基抑制。
六、使用范例：
6.1 UC-MSC原代培養(yǎng) （組織塊法）
6.1.1無菌條件下取新鮮臍帶，用DPBS漂洗凈血跡
注1：?一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用75%酒精潤(rùn)洗。
6.1.2置10cm 培養(yǎng)皿中，剪成1~2cm臍段，剔除血管，用DPBS洗凈血跡，再剪成1mm3組織塊。(圖 1)
6.1.3用無菌滴管吸取少量細(xì)小組織塊均勻散布在 6 孔板 2 個(gè)孔中。
6.1.4?37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育 30min，以使組織塊粘貼在培養(yǎng)皿壁上。
6.1.5?向每孔滴加0.8ml 完全培養(yǎng)基 (注意沿孔壁小心滴加，勿使沖動(dòng)組織塊)。
6.1.6?37℃，5% CO2?培養(yǎng)箱孵育過夜，次日 (D1) 每孔再補(bǔ)加1ml 完全培養(yǎng)基。
6.1.7?37℃，5% CO2?繼續(xù)培養(yǎng)，5天 (D6) 后半量換液 (此時(shí)一般看不到細(xì)胞，但最快3天就可看到細(xì)胞從組織邊沿爬出)。
6.1.8再過5天后半量換液 (此時(shí)一般會(huì)有細(xì)胞爬出，但最晚可到14天會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞從組織邊沿爬出) (圖2、圖3)。
6.1.9每2天換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2~4天，待細(xì)胞融合度（Confluency）達(dá)到約80%后傳代培養(yǎng)(圖4)。
注1：組織塊培養(yǎng)的關(guān)鍵是要保障組織塊始終貼壁，換液動(dòng)作要盡可能輕微，避免沖動(dòng)組織塊。培養(yǎng)基加量不能太多，以免組織塊漂浮。
注2：為增加成功率，從原代分離臍帶和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,培養(yǎng)基可加2.0 %?PLTGold??血小板裂解物。
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6.2?UC-MSC原代培養(yǎng)?（消化法）
MSC NutriStem??無血清培養(yǎng)基也能有效地培養(yǎng)消化法取得的原代細(xì)胞，操做方式如下：
6.2.1?將臍帶用DPBS漂洗干凈，剪成1-50px,后剔除血管。
注1：一般臍帶取得非無菌環(huán)境，可以稍微用75%酒精潤(rùn)洗。
6.2.2將組織剪成3-5mm3后，移入50ml離心管，再加入的分離液。
注1：一條長(zhǎng)度10公分的臍帶建議加入10ml的分離液；或者組織塊 : 分離液（vol）= 1:1。
注2：?視情況而定，可自行在分離液中添加1%青鏈雙抗（BI, Cat# 03-031-1B）。
6.2.3把50ml離心管橫放在37度細(xì)胞培養(yǎng)箱，過夜反應(yīng)（16小時(shí)）。
注1：若總反應(yīng)體積較大，也可持續(xù)旋轉(zhuǎn)混合。
6.2.4加入和分離液等體積的0.05%EDTA（BI, Cat#03-015-1B）終止反應(yīng)后，1500 xg離心5分鐘，去除上清。
注1：溶液比較濃稠，小心不要影響下層的細(xì)胞;建議留下5ml左右的溶液。
注2：?若是脂肪組織，沒有粘稠的情形，以常規(guī)的200-300 xg離心即可。
注3：沒有EDTA, 可使用無鈣鎂DPBS取代；此時(shí)建議后面步驟6多重復(fù)2-3次，以確實(shí)去除酵素。
6.2.5以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，500 xg離心5分鐘，去除上清。
6.2.6再次以和分離液等體積的無鈣鎂DPBS重懸細(xì)胞后，250 xg離心5分鐘，去除上清。
6.2.7用適量的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞后，即可按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法接種P0代細(xì)胞培養(yǎng)。
注1：消化后的原代細(xì)胞，建議培養(yǎng)時(shí)接種密度提高到10,000/cm2以上；傳代后即可按常規(guī)的接種密度培養(yǎng)。
6.3 UC-MSC傳代培養(yǎng)與凍存
6.3.1待細(xì)胞融和度達(dá)到約80%后進(jìn)行傳代（細(xì)胞不能太密集，否則容易分化），吸棄傳代板孔中的培養(yǎng)基，每孔加適量DPBS輕輕沖洗1次。
6.3.2根據(jù)培養(yǎng)皿適量加入重組胰酶-EDTA（貨號(hào)：03-079-1A，T25建議使用1ml），在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱作用3~5 min（可輕拍培養(yǎng)瓶幫助細(xì)胞脫落）。
6.3.3顯微鏡下觀察細(xì)胞完全脫落后，使用5-10ml稀釋大豆胰酶抑制劑（SBTI, 貨號(hào)：03-048-1，1X），1000rpm離心3~5min。
6.3.4謹(jǐn)慎吸出上清，細(xì)胞團(tuán)塊用適當(dāng)體積的完全培養(yǎng)基懸浮后，混勻細(xì)胞懸液。
6.3.5按照所需的比例進(jìn)行傳代或按照5000-6000cells/cm2的細(xì)胞密度將細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中，放入37℃, 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
6.3.6每2-3天更換一次培養(yǎng)基，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時(shí)，參照操作步驟6.3.1~6.3.5做細(xì)胞傳代；或者參照操作步驟6.3.1~6.3.3收獲細(xì)胞凍存。
6.3.7細(xì)胞凍存：將細(xì)胞團(tuán)塊懸浮于適量 (0.5~1×106cells/ml) D10無血清 凍存液（貨號(hào)：05-713-1）中，裝入凍存管，2~8℃冰箱放置30min，-80℃冰箱放置 24h，轉(zhuǎn)入液氮罐凍存。
注1：本方法僅供參考，用戶可根據(jù)自身經(jīng)驗(yàn)做合理調(diào)整。
附圖：（如下是組織塊法，建議客戶可以嘗試消化法）
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