摘要：
提取小鼠肌肉dna所使用的四種均質(zhì)法進(jìn)行對(duì)比。1.手動(dòng)液氮研磨（研缽和杵），2.opsd的cryogrinder液氮研磨，3.轉(zhuǎn)子定子研磨，4.ht homogenizer 高通量組織研磨機(jī)。用上述四種方法對(duì)dna產(chǎn)率，純度和片段大小的參數(shù)進(jìn)行比較。轉(zhuǎn)子－定子勻漿器產(chǎn)生的最小的片段，而cryogrinder產(chǎn)生最大的dna片段，ht homogenizer的dna產(chǎn)量最高，而傳統(tǒng)的液態(tài)氮冷凍手動(dòng)研缽研磨dna產(chǎn)量最少。ht homogenizer珠磨式產(chǎn)生最高純度的樣品，轉(zhuǎn)子-定子提取的dna純度最低。
簡(jiǎn)介：
樣品破碎是rna，dna和蛋白質(zhì)分離的早期必要步驟，分為物理破碎和化學(xué)破碎。化學(xué)方法通常依賴于去除劑（detergents）和離液劑（chaotropes）；物理法則包括混合研磨機(jī)（磁珠攪拌器）、超聲、研缽和杵、及手持式均質(zhì)器（轉(zhuǎn)子-定子法）。
雖然化學(xué)裂解往往是最有效的方法，但它破壞固體組織并不總是完全可靠。機(jī)械破碎的兩種常用方法是通過(guò)使用轉(zhuǎn)子-定子，它涉及剪切或切割，并通過(guò)珠磨儀或研缽和杵進(jìn)行二次粉碎。
轉(zhuǎn)子-定子用于快速剪切樣品。它實(shí)質(zhì)上是一個(gè)圓形的剪刀，非常類似手持式均質(zhì)器。轉(zhuǎn)子-定子是均質(zhì)樣本的典型工具。ht高通量組織研磨機(jī)，用于單個(gè)樣品或高通量應(yīng)用。8字形的運(yùn)行方式已被往復(fù)直線運(yùn)動(dòng)取代。研缽和杵是用于磨樣的歷史性的工具。它可有效分離樣品dna和rna。cryogrinder?作為代替研缽的最小型研磨器，可用于研磨非常微量的樣品（100毫克左右）。
本文用市售的試劑盒在四種研磨方式中進(jìn)行比較。
材料和方法
組織樣品：雌性cd1小鼠42天（charles river實(shí)驗(yàn)室），使用和提取的腿部肌肉，冷凍，并貯存于-140℃下。均質(zhì)化，組織解凍，如下所述進(jìn)行處理。
組織dna純化：小鼠肌肉（25毫克），使用qiaamp dna mini試劑盒。
小鼠肌肉組織用cryogrinder冷凍均質(zhì)或研缽與杵液氮處理后轉(zhuǎn)移到溶液中。
而rotor-stator轉(zhuǎn)子-定子 和 ht homogenizer 高通量組織研磨機(jī)的樣品則直接在緩沖液中勻漿。在這兩種情況下，隨后加入sds和蛋白酶k。
純化的dna在260和280nm處通過(guò)分光光度法進(jìn)行分析，以測(cè)量濃度和純度。瓊脂糖凝膠電泳（在1x tae緩沖液的1％瓊脂糖）被用來(lái)評(píng)估分離的dna的片段大小。dna樣本電泳前用20x酒精沉淀。
均質(zhì)化方法：用液氮冷卻的研缽和杵（coors）； cryogrinder液氮冷凍研磨器（opsd）；轉(zhuǎn)子-定子均質(zhì)器（virtis）；ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)（opsd）進(jìn)行。如下：
表1.均質(zhì)化小鼠肌肉組織的方法
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研缽和杵（手動(dòng)） |
樣品（25mg），用液氮冷凍，置于低溫冷凍150mm研缽中，用冷卻的研杵手動(dòng)粉碎。粉碎的肌肉被轉(zhuǎn)移到一個(gè)冷卻的2ml離心管中，并懸浮于裂解溶液中。 |
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cryogrinder? (電動(dòng)研缽和杵) （opsd） |
樣品（25mg）從制冷機(jī)（盛放液氮的裝置）取出后放入預(yù)冷cryogrinder缽體，慢慢調(diào)試至合適的速度后粉碎樣品，后轉(zhuǎn)移到一個(gè)冷卻的2ml離心管中，并懸浮于裂解溶液中。 |
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ht高通量組織研磨機(jī)（opsd） |
樣品（25mg）置于96孔板中，含1個(gè)4mm不銹鋼研磨球，加緩沖液，1200轉(zhuǎn)2min。將裂解物轉(zhuǎn)移到2ml的離心管中。 |
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rotor-stator （virtis） |
樣品（25mg）加入緩沖液以10k轉(zhuǎn)速，6mm的直徑，4毫升離心管勻漿2分鐘（virtis）。將裂解物轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中 |
結(jié)果
表2.光密度，比率，純化的dna產(chǎn)量
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260 nm |
280 nm |
ratio |
dna yield (μg) |
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ht homogenizer |
1.50 |
0.85 |
1.77 |
30.1 |
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rotor-stator |
0.71 |
0.55 |
1.29 |
14.2 |
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mortar and pestle研缽和杵 |
0.20 |
0.14 |
1.41 |
4.0 |
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cryogrinder |
0.46 |
0.29 |
1.60 |
9.2 |
樣品均質(zhì)化的方法影響dna產(chǎn)量，純度和片段大小。
dna產(chǎn)量：ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)提取的dna產(chǎn)量最高，隨后是轉(zhuǎn)子-定子和cryogrinder，而研缽和杵的dna產(chǎn)率最低。
dna純度：ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)的260/280比率表明其純度最高，cryogrinder也有較高的純度，其次是研缽和杵，轉(zhuǎn)子-定子純度最低。
片段大小：片段大小受均質(zhì)化方法的影響顯著，轉(zhuǎn)子-定子剪切法從約15kb處產(chǎn)生連續(xù)片段（圖1），ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)產(chǎn)生比轉(zhuǎn)子-定子更窄的大片段范圍，cryogrinder產(chǎn)生了比其他方法更寬范圍的大片段。除了片段大小之外，在對(duì)應(yīng)于ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)，轉(zhuǎn)子-定子和cryogrinder的樣品的孔中存在顯著的熒光（較大分子量的分子片段）。
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figure 1. purified dna analyzed on 1% agarose gel (1x tae) with lambda-hindiii size markers. lane 1 - lambda hindiii digest lane 2 - ht homogenizer lane 3 - rotor-stator lane 4 - mortar and pestle lane 5 - cryogrinder lane 6 - lambda hindiii digest |
討論
一、根據(jù)不同均質(zhì)化方法對(duì)dna產(chǎn)量，片段大小和純度影響，得出結(jié)果：
1. ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)的dna產(chǎn)量最高，純度最佳。
2. cryogrinder低溫研磨產(chǎn)生了大片段dna，但產(chǎn)量和純度較低。
3. 轉(zhuǎn)子-定子具有良好的產(chǎn)率，但純度很低，片段最小。
4. 研缽和杵具有良好的dna片段，但dna純度相對(duì)較低，產(chǎn)量很低。
簡(jiǎn)言之，沒(méi)有一個(gè)方法可達(dá)到dna的產(chǎn)量最高，純度最高，和片段最佳。
二、dna片段大小作為均質(zhì)化的直接后果效果顯著
1. 轉(zhuǎn)子-定子依賴于旋轉(zhuǎn)刀剪切組織產(chǎn)生相對(duì)較小dna片段。
2. cryogrinder冷凍研磨器，通過(guò)粉碎和研磨，產(chǎn)生的相對(duì)大的dna片段。
3. ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)和cryogrinder冷凍研磨器的粉碎顯然比轉(zhuǎn)子-定子剪切對(duì)dna的有害影響更小。
4. 在微量樣品中，研缽研磨難以收集粉碎樣品，得到 dna產(chǎn)量非常少。研缽和杵的這個(gè)產(chǎn)量問(wèn)題是開(kāi)發(fā)cryogrinder冷凍研磨器的最佳理由。
5. cryogrinder冷凍研磨器具有微型砂缽（約1/2英寸直徑），阻止粉碎樣品的擴(kuò)散，并在研磨后得到有效的回收樣品。
三、不管來(lái)源如何，重要的是注意內(nèi)在或外在因素會(huì)影響dna的最終純度
由不同均質(zhì)方式產(chǎn)生的不同程度的樣品純度難以解釋（表2）。 勻漿后，所有樣品都加sds、蛋白酶k，然后用qiaamp dna mini kit純化。該試劑盒旨在去除雜質(zhì)，結(jié)果基于260/280比為1.29至1.77。可能是，轉(zhuǎn)子-定子、研缽和杵引入來(lái)自樣品外的污染物。而ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)使用消耗性的試管和鋼珠，可避免污染。
四、根據(jù)應(yīng)用，每種破碎方式都具有價(jià)值
對(duì)于微量樣品，cryogrinder冷凍研磨器產(chǎn)生較大的片段和良好的產(chǎn)量。
而ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)通過(guò)撞擊可產(chǎn)生最大片段dna，通量高是ht homogenizer高通量組織研磨機(jī)的最大優(yōu)勢(shì)。
五、越來(lái)越多的場(chǎng)合需要處理低溫保存的細(xì)胞和生物樣品
溫度敏感的樣品（如原代和培養(yǎng)的細(xì)胞，蛋白質(zhì)、rna）等如果加熱或解凍，會(huì)喪失生物活性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，opsd設(shè)計(jì)了cryocooler?，這是保存培養(yǎng)細(xì)胞和組織標(biāo)本冷凍小瓶完整性的有價(jià)值的工具。這種便攜式低溫工作站可以與cryogrinder研缽和杵系統(tǒng)配對(duì)，以在低溫下研磨樣品并儲(chǔ)存運(yùn)輸樣品。
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