糖尿病是全球對人類健康有害的且最難根治的代謝疾病之一。最近的研究表明, 由胰島巨噬細胞重編程引起的慢性炎癥顯著促進了肥胖向Ⅱ型糖尿病的轉化。重編程的胰島巨噬細胞不僅破壞了胰島素的分泌能力, 而且導致β細胞增生和變性。盡管已經有研究表明, 胰島內巨噬細胞的增殖可能受到細胞間接觸和β細胞釋放的ATP調節, 但在脂肪酸或葡萄糖水平升高的情況下, 胰島衍生的特異性局部信號傳導和胰島內巨噬細胞重編程的確切機制仍不清楚。

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G蛋白耦聯受體（GPCRs）是一個“和G蛋白連接才能工作的受體”, 它通常位于細胞膜上并且參與大部分生理功能的調節。肥胖和糖尿病的發生經常伴隨著脂質過氧化物的增加, 脂質過氧化物通?？梢约せ頖PCR發揮作用。有研究表明胰島內源性脂肪酸通過激活GPR120可以調控胰島δ細胞-β細胞環路從而激活下游信號通路。GPR132是GPCRs的一種, 可識別溶血磷脂酰膽堿, 環氧二十碳三烯酸和9(S)-HODE, 然而GPR132在胰島巨噬細胞中扮演的角色仍未得到深入研究。

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2023年9月,?山東大學于曉團隊，北京大學孫金鵬團隊聯合焦寧團隊通過冷凍電鏡對GPR132-鳥嘌呤核苷酸結合蛋白(Gi)與其配體的結構進行解析, 發現了GPR132與其配體識別和激活的結構機制，而且開發了GPR132定向選擇性激動劑NOX-6-1。此外，研究團隊通過將弱激動劑NOX-6-1中酰胺連接改為磺酰胺連接，發現其不僅消除了Gi的活性，并拮抗了內源性配體激活Gi活性。研究團隊采用分子動力學模擬、FlAsH-BRET和生化實驗相結合的方法來評估化合物的結合位置，發現了GPR132拮抗劑與激動劑之間轉變的關鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）。通過研究發現NOX-6-18能夠調節胰島巨噬細胞重編，減少體重增加，促進葡萄糖代謝。

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1.GPR132參與胰島巨噬細胞重編程

首先, 研究者發現高脂飲食小鼠的胰島巨噬細胞中的炎癥因子顯著上調, 并且用有機溶劑裂解提取的胰島巨噬細胞的炎癥因子表達水平顯著高于甲醇溶解提取的部分, 說明這些炎癥因子與脂質代謝有關, 通過質譜分析, 研究者發現9(S)-HODE，二十二碳六烯酸和花生四烯酸水平在高脂飲食小鼠的胰島組織中顯著升高。然而, 只有9(S)-HODE能夠促進胰島巨噬細胞中的炎癥因子的表達, 并且促進巨噬細胞增值, 與此同時, 9(S)-HODE的增加會導致GPR132的高表達。而胰島巨噬細胞特異性敲除GPR132會逆轉9(S)-HODE誘導的炎癥因子的表達。這些結果表明GPR132在內源性脂質刺激或高脂飲食壓力下會發生巨噬細胞重編程。

圖1 胰島巨噬細胞重編程過程中GPR132信號通路的上調

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2.GPR132-Gi信號有助于胰島巨噬細胞的重編程

為了進一步研究GPR132-Gi與巨噬細胞重編程的關系, 用9(S)-HODE處理胰島巨噬細胞, 發現胰島巨噬細胞中的吞噬能力增加, 炎癥因子Il1b, Tnf, Ccl2和Cxcl1 mRNA水平顯著升高。然而經Gi抑制劑百日咳毒素 (PTX) 預處理后，由9(S)-HODE引起的胰島巨噬細胞炎癥反應明顯降低。同樣, 使用Cre品系動物+DIO病毒 (pADV-mCMV-DIO-pertussis toxin subunit 1 (TOX1)-P2A-EGFP) 在胰腺巨噬細胞過表達PTX也出現了同樣的效果。這些結果表明GPR132在胰島巨噬細胞中介導的功能參與了9(S)-HODE誘導的胰島炎癥反應和胰島巨噬細胞重編程。

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圖2 GPR132- Gi信號有助于胰島巨噬細胞重編程和GPR132復合物樣品制備

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3.冷凍電鏡對apo-GPR132–Gi1, NPGLY–GPR132–Gi1和9(S)-HODE–GPR132–Gi1復合物的結構解析
研究團隊利用冷凍電鏡解析了NPGLY-GPR132-Gi和9(S)-HODE–GPR132–Gi1的結構,通過分析發現，兩種內源性配體通過兩個不同的口袋與GPR132受體結合, NPGLY占據配體結合口袋左側使口袋呈“L”形, 而9(S)-HODE具有更深的配體結合位置。雖然兩種配體具有不同的結合口袋, 但是兩種激動劑9(S)-HODE和NPGLY具有相似的激活機制, 都是通過與GPR132的Y127^3.37和Y200^5.39發生直接交互作用。此外，用丙氨酸殘基替換GPR132的F208^5.47, Y258^6.51和H259^6.52殘基會損害GPR132對NPGLY或9(S)-HODE的激活作用, 說明由Y258^6.51-F208^5.47-H259^6.32-F255^6.48組成的疏水鏈的構象重排是內源性激動劑激活GPR132的共同機制。這些結果表明GPR132配體口袋的可塑性以及對NPGLY或9(S)-HODE結合和激活至關重要的關鍵殘基的識別可能有助于合理設計選擇性GPR132激動劑或拮抗劑。

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圖3 GPR132–Gi的冷凍電鏡結構

圖4 GPR132的組成活性以及NPGLY和9(S)-HODE對GPR132的結合和激活的結構基礎

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4.基于GPR132結構的分子化合物的篩選

GPR132的選擇性激動劑有助于及時識別GPR132在特定生理過程中所起的精確作用，并且可以通過對激動劑的修飾衍生出GPR132的拮抗劑。因此，研究者進行了計算機輔助虛擬篩選, 以確定調節GPR132的潛在的活性候選化合物。通過SiteMap算法, 以及分子動力學模擬，分別計算了兩個“正構位點”殘基的能量貢獻, 并結合突變驗證，確定了配體設計的熱點殘基。另外, 研究者通過NOX多樣性小分子化合物庫，發現苗頭化合物NOX-6-1（EC50約為1124nM）。通過藥物設計, 藥物化學合成以及藥理學表征，最終成功地發現了GPR132選擇性激動劑NOX-6-7（EC50約為30nM）。接下來，研究者將NOX-6-7注入了小鼠胰島巨噬細胞中, 發現它能夠誘導胰島巨噬細胞重編程，并增加胰島巨噬細胞的吞噬能力。然而, 這些作用會被Gi抑制劑-PTX消除。這些結果表明，NOX-6-7是評估GPR132下游Gi信號功能的有用分子，GPR132中的Gi信號在胰島穩態中起重要作用。

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圖5 基于Gi基礎的GPR132激動劑開發

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5.GPR132拮抗劑的篩選-NOX-6-18

此外，研究團隊通過將弱激動劑NOX-6-1中酰胺連接改為磺酰胺連接，發現其不僅消除了Gi的活性，并拮抗了內源性配體激活Gi活性。研究團隊采用分子動力學模擬, FlAsH-BRET和生化實驗相結合的方法來評估化合物的結合位置, 發現了GPR132拮抗劑與激動劑之間轉變的關鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）。接下來，我們進行了計算模擬，以了解NOX-6-18如何與GPR132相互作用。在最終的模型中，插入口袋1中的NOX-6-18的羧酸頭與GPR132的R203^5.42發生電荷基相互作用。另外, NOX-6-18的4-氧-4-苯基丁胺與GPR132的TM3, ECL2, TM5-7的疏水殘基以及與Y258^6.51和K265^6.58的氫鍵形成廣泛的疏水接觸。并且，研究結果表明NOX-6-18與GPR132中TM5-TM7特異性殘基之間的相互作用是NOX-6-18對GPR132選擇性的決定因素。

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圖6 選擇性GPR132拮抗劑的研制

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6.NOX-6-18對高脂飲食小鼠糖代謝的影響

接下來，為了確定合成的GPR132拮抗劑是否在體內產生有益的代謝作用。研究者在高脂飲食誘導的雄性和雌性小鼠中，給予NOX-6-18治療12-14周，發現NOX-6-18能夠改善高脂飲食引起的體重增加, 此外，高脂飲食小鼠的葡萄糖耐量和胰島素耐量得到顯著改善。另外, 在NOX-6-18治療4-6周后, NOX-6-18顯著降低了胰島, 肝臟和脂肪組織的炎癥水平，并且減少了胰島組織中的巨噬細胞數量, 進而改善了代謝紊亂。這些結果表明，在飼喂高脂飲食的小鼠中，給予拮抗劑NOX-6-18能夠顯著增強胰島巨噬細胞的葡萄糖代謝，并以GPR132依賴的方式降低其增殖速率和重編程程度。

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圖7 GPR132拮抗劑改善高脂飲食喂養小鼠的葡萄糖代謝

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文章結論與展望

總的來說, 作者通過代謝組學結合分子學實驗,?發現了9(S)-HODE的水平以及GPR132的表達水平與糖尿病呈正相關, 通過反向驗證 (基因敲除), 發現GPR132在內源性脂質刺激或高脂飲食壓力下會發生巨噬細胞重編程。另外通過冷凍電鏡, 分子動力學模擬, FlAsH-BRET以及化合物篩選發現了GPR132拮抗劑與激動劑之間轉變的關鍵作用殘基，最終找到了GPR132的強效選擇性拮抗劑NOX-6-18（IC50約為14nM）, 其在改善糖尿病的進程中發揮了顯著的作用, 為糖尿病的臨床治療提供了一個可靠的治療途徑。

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原文鏈接: https://www.nature.com/articles/s42255-023-00899-4