?

?

論文標題：Induction of m6A methylation in adipocyte exosomal LncRNAs mediates myeloma drug resistance

刊登日期：2022年01月

發表雜志：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

影響因子：12.658

研究機構：休斯頓衛理公會癌癥中心，休斯頓衛理公會研究所，廈門大學醫學院癌癥研究中心，德克薩斯大學安德森癌癥中心血液學系

技術手段：m6A測序、聯川生物OmicStudio云平臺

?

?

文章架構

?

?

?

1、來自MM患者脂肪細胞的外泌體對化療誘導的MM細胞凋亡具有保護作用

?

圖1

?

該研究首先從正常骨髓（NADs）和多發性骨髓瘤（MM）患者骨髓（PtADs）中分離出脂肪細胞，利用透射電鏡觀察到從脂肪細胞培養液上清中收集到的外泌體呈杯狀。隨后將MM細胞與外泌體共培養，利用共聚焦顯微鏡發現被標記上Dil的外泌體存在于MM細胞的細胞膜上，并在胞漿內移動，表明脂肪細胞外泌體能夠被MM細胞吸收。 該研究還發現NADs和PtADs的外泌體均能抑制化療藥物bortezomib(BTZ)誘導的MM細胞凋亡，其中PtADs外泌體的抑制作用更明顯。說明脂肪細胞外泌體對MM耐藥性具有潛在影響。

圖2

?

將幾種MM細胞系及對應化療藥物與MM相關脂肪細胞（MMADs）中的外泌體共培養，NADs外泌體作為對照。結果發現，與NADs相比，MMDAs外泌體顯著降低了化療藥物的治療效果。表明MM細胞可能增強脂肪細胞外泌體對MM細胞化療耐藥性的影響。

?

2、脂肪細胞外泌體攜帶的lncRNAs抑制MM細胞凋亡

?

圖3

?

與NADs外泌體的lncRNAs相比，MMADs外泌體的lncRNAs（LOC606724和SNHG1）顯著上調。利用MMRF CoMMpass RNA-seq數據庫分析，發現LOC606724和SNHG1的表達與患者總生存期呈顯著正相關。并且在MM細胞中過表達或敲除這兩個lncRNAs可分別抑制或增強化療藥物的療效。表明MMADs外泌體攜帶的lncRNAs對化療誘導的MM細胞凋亡具有保護作用。

?

?

SNHG1已被證明參與調控腫瘤生長，作者后續對LOC606724如何調控MM細胞凋亡進行了研究。發現過表達或敲除脂肪細胞中的LOC606724可分別使MMADs中的癌蛋白c-Myc顯著上調或下調，但不影響c-Myc mRNAs表達。表明LOC606724在轉錄后水平上調MM細胞中的c-Myc蛋白。

?

elF4E是蛋白翻譯中的關鍵分子，通過RIP檢測，發現c-Myc蛋白可與elF4E蛋白結合，并顯著富集于過表達LOC606724的MM細胞，而過表達c-Myc可抑制化療藥物的療效。表明LOC606724通過結合elF4E參與介導c-Myc蛋白合成。

?

?

3、MM細胞促進IncRNA向脂肪細胞外泌體富集

?

圖5

?

通過分析NADs和MMADs在細胞或外泌體中lncRNAs的表達水平，發現外泌體中的lncRNAs顯著上調，并且MMADs外泌體中的lncRNAs水平明顯高于NADs。利用RNA pull-down實驗檢測到lncRNAs包裝至外泌體中所需的RNA結合蛋白（hnRNPA2B1和hnRNPU）。利用這兩個蛋白的抗體進行RIP實驗，發現lncRNAs在MMADs中顯著富集。利用siRNAs下調MMADs中的這兩個蛋白后，可使MMADs外泌體中的lncRNAs下調，并誘導更多的MM細胞凋亡。這些結果表明，MM細胞可促進脂肪細胞中與RNA結合蛋白結合的lncRNAs被包裝到外泌體中。

?

4、脂肪細胞中METTL7A介導的lncRNAs m6A甲基化的鑒定

?

圖6

?

使用MeRIP-seq對脂肪細胞進行研究，與NADs相比，MMADs中存在lncRNAs的甲基化。然后通過lncRNAs pull-down實驗，發現MMADs裂解物中存在METTL7A。RIP實驗進一步證實LOC606724富集于METTL7A。 隨后作者通過構建和純化His標記的重組METTL7A融合蛋白，進行了體外甲基轉移酶活性分析，證實METTL7A具有m6A甲基轉移酶活性，并且酶活性主要來自于METTL7A蛋白76-172 AA。然后作者利用SRAMP軟件發現LOC606724上存在七個潛在的m6A motifs，并通過體外甲基化分析發現METTL7A蛋白可增加含有M5基序的RNA寡核苷酸的m6A水平。其中M5基序位于LOC606724的481nt處并含有AMP，當將這個AMP變為GMP后，m6A酶活性明顯降低。這表明METTL7A蛋白的76-172AA與LOC606724的第481位AMP甲基化有關。

?

?

下一步，作者構建了MMADs的METTL7A沉默表達載體（siMETTL7A），通過m6A-RIP實驗，發現MMADs中的m6A水平顯著降低，lncRNAs對RNA結合蛋白的富集度下降，并導致外泌體lncRNAs顯著下調。將MM細胞與siMETTL7A-MMADs的外泌體共培養后，MM細胞凋亡率明顯提高。這些結果表明，具有甲基化轉移酶活性的METTL7A有助于lncRNAs的m6A甲基化，甲基化的lncRNAs可以富集在脂肪細胞外泌體中。

?

5、MM細胞通過EZH2介導的蛋白質甲基化增強脂肪細胞的METTL7A活性

?

圖7

?

通過使用抗METTL7A抗體拉下脂肪細胞裂解物，檢測到MMADs免疫沉淀物中的METTL7A蛋白甲基化水平高于NADs的免疫沉淀物，表明MM細胞增強了METTL7A蛋白的甲基化。 EZH2是一種賴氨酸甲基轉移酶，可以使組蛋白和非組蛋白甲基化。EZH2在MMADs中的表達水平高于NADs。作者構建的EZH2沉默載體（siEZH2）可使MMADs中的METTL7A蛋白甲基化水平以及lncRNAs表達水平降低，并使化療藥物治療后的MM細胞凋亡率明顯提升。表明EZH2能夠增強脂肪細胞中METTL7A活性，從而促進lncRNAs甲基化，減少化療后MM細胞的凋亡率，最終增強MM細胞的耐藥性。

?

圖8

?

接著作者構建了PDX模型，注射靶向藥（bortezomib或tazemetostat）兩周后，發現小鼠骨髓瘤明顯縮小，并降低了脂肪細胞外泌體中lncRNAs的表達。構建EZH2敲除的MM小鼠模型后，發現靶向藥治療效果變得更好，并提高了小鼠生存率，而脂肪細胞中的METTL7A甲基化水平降低。表明脂肪細胞EZH2對MM細胞化療具有潛在作用。

總之，該研究通過體外和體內實驗，發現MM患者脂肪細胞中收集的外泌體及其中的lncRNAs (LOC606724和SNHG1)均可抑制化療誘導的MM細胞凋亡，即增強了骨髓瘤細胞的耐藥性。通過RIP、MERIP-seq和RNA-Protein pull-down實驗發現lncRNAs可以與METTL7A蛋白互作，同時證實了METTL7A具有RNA甲基轉移酶活性；最后研究表明MM細胞通過EZH2介導的METTL7A蛋白甲基化增強了METTL7A活性，從而促進lncRNAs包裝到脂肪細胞外泌體中。該研究指出了一種通過阻斷外泌體介導的腫瘤惡性循環來提高癌癥治療效果的潛在策略。