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近日，紐約大學Grossman醫學院等團隊在《Nature》最新子刊《Nature Cardiovascular Research》上發表了名為“Systems immunology-based drug repurposing framework to target inflammation in atherosclerosis”的研究。研究發現，一種目前已經作為癌癥、肺部疾病和阿爾茲海默病潛在療法的實驗性藥物-塞卡替尼或能減緩導致心臟病發生的動脈粥樣硬化的進展。Chiara Giannarelli團隊通過Standard BioTools 質譜流式技術（CyTOF?）建立了一種臨床前的驗證策略來探究系統免疫驅動藥物的新用途，有助于人類心血管疾病免疫療法的開發。

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動脈粥樣硬化心血管疾?。ˋSCVD）是全球死亡的主要原因，但是與其他復雜疾病疾病如癌癥相比，新的心血管藥物的開發較為滯后。ASCVD當前的治療標準是降低脂質水平并控制其他心血管危險因素（例如糖尿病，高血壓），免疫調節治療能調節ASCVD患者的炎癥性反應并降低中風和心肌梗死風險，但針對ASCVD潛在的炎癥機制的藥物開發一直停滯不前，這在一定程度上是由于傳統藥物開發耗時費力且需要大量資金投入。因此，Giannarelli團隊通過CyTOF?質譜流式技術開發了一種在炎癥性疾病中為舊藥物尋找新用途的逆向工程學方法。

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圖1. 質譜流式實驗設計流程

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為了表征人動脈粥樣硬化中免疫細胞的功能失調，研究者共使用了58位病人的血液樣本進行系統性的檢測與分析。

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首先，研究者從頸動脈粥樣硬化患者中分離出外周血單核細胞（PBMC），并將其暴露于自體血漿或健康捐獻者的血漿中，并通過質譜流式檢測主要免疫細胞信號通路的激活情況。通過viSNE將細胞分成10群主要的免疫細胞亞群，為了進一步探究每個群體中激活的細胞內信號通路，研究者又分析了了10種胞內蛋白的磷酸化情況，結果顯示，相比于健康捐獻者血漿，動脈粥樣硬化患者自體血漿會誘導PBMC中的CD14+ 單核細胞和 CD1c+ 樹突狀細胞的多蛋白（CREB, p38, ERK1/2, MAPKAPK2 and S6）的磷酸化激活。說明動脈粥樣硬化患者的血漿在循環炎癥細胞中誘導了強烈且特異的先天免疫細胞信號應答。

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圖2. 單細胞質譜流式揭露動脈粥樣硬化病人PBMC在自體血漿刺激下的信號變化

b：動脈粥樣硬化病人主要細胞類型和磷酸化蛋白熱圖;??c：動脈粥樣硬化病人主要PBMC細胞分群t-SNE圖;??d：動脈粥樣硬化病人免疫細胞在自體血漿或健康人血漿刺激下的單細胞信號模式t-SNE圖;??e：動脈粥樣硬化病人在自體血漿或健康人血漿刺激下CD14+ 單核細胞和 CD1c+ 樹突狀細胞的胞內激酶的磷酸化情況

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接著，研究者再次通過多參數質譜流式探究了暴露在動脈粥樣硬化患者血漿中的健康免疫細胞內的信號傳導，同時檢測了細胞因子表達譜。結果顯示，動脈粥樣硬化病人的血漿可以影響健康細胞的炎癥反應應答，其中CD14+ 單核細胞和 CD1c+樹突狀細胞展現出了最強的免疫激活功能，引起多種蛋白（CREB, p38, ERK1/2, MAPKAPK2 and S6）磷酸化。

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圖3. 多參數質譜流式檢測健康免疫細胞在動脈粥樣硬化病人血漿刺激下的胞內信號

a: 健康免疫細胞在動脈粥樣硬化病人血漿或健康人血漿刺激下的免疫細胞熱圖;??b: 健康人主要PBMC細胞分群t-SNE圖;??c: 健康免疫細胞在動脈粥樣硬化病人血漿或健康人血漿刺激下的胞內信號模式t-SNE圖;??d: 健康免疫細胞在自體血漿或健康人血漿刺激下CD14+ 單核細胞和 CD1c+ 樹突狀細胞的胞內激酶的磷酸化情況

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而后，研究者通過質譜流式探究了動脈粥樣硬化患者和健康供體的PBMC中存在的不同的靜息和刺激免疫反應。以上結果表明，盡管動脈粥樣硬化患者和健康供體的循環免疫細胞在基線時的炎癥信號和健康血漿刺激下的炎癥反應存在一定差異，但面對患者血漿的刺激，健康供體和動脈粥樣硬化患者的PBMC具有相似的炎癥反應，而動脈粥樣硬化患者具有更強的循環免疫細胞炎癥反應應答主要是由于與其自身血漿反應。

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研究者設計了一種藥物再利用的方法，深入分析了4823個基因，其中包括277個已知在炎癥過程中扮演關鍵作用并能產生細胞因子和促進機體慢性炎性反應的蛋白質，該預測方法從L1000化合物篩選文庫中發現現有的小分子以逆轉對動脈粥樣硬化血漿的炎癥反應，藥物篩選基于磷酸化CyTOF篩選、基因表達分析以及健康PBMC中存在或不存在候選藥物時PBMC和斑塊對動脈粥樣硬化血漿的細胞因子分泌的綜合分析。

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通過該方法，研究者篩選出8個候選藥物，其中通過質譜流式檢測多種磷酸化蛋白后發現塞卡替尼對動脈粥樣硬化患者血漿誘導的大多數特異性激酶和TF磷酸化有顯著的抑制作用。為了進一步闡明塞卡替尼如何改變動脈粥樣硬化斑塊誘導的信號傳導，研究者進行了進一步的磷酸化CyTOF實驗來研究LCK、SRC和AKT，并證實動脈粥樣硬化斑塊增加了SRC和AKT的蛋白表達及其在CD14+單核細胞中的磷酸化，且無論動脈粥樣硬化影響的血管部位如何，塞卡替尼都具有抗炎作用?？偟膩碚f，這些結果表明，塞卡替尼不僅對循環免疫細胞具有抗炎和抗動脈粥樣硬化作用，而且直接對人類動脈粥樣硬化組織具有一定作用。

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圖4. 候選藥物的磷酸化CyTOF檢測

a-d：識別動脈粥樣硬化疾病和離體的候選抗炎小分子的篩選方法流程圖;??e: CyTOF檢測不同免疫細胞在單獨動脈粥樣硬化病人血漿以及配合不同候選藥物處理下的單細胞磷酸化熱圖;??f：單細胞和樹突狀細胞磷酸化情況的t-統計分析

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最后，通過質譜流式分析檢測了小鼠模型的循環免疫細胞，探究了塞卡替尼在動物動脈粥樣硬化模型中也能發揮抗動脈粥樣硬化和抗炎作用。

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圖5. 動物模型中的質譜流式檢測

CyTOF分析對照組以及不同處理下的16周小鼠全血中的循環免疫細胞組成

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在本研究中，研究人員并未嘗試耗費大量時間和資金從頭開發一種合適的藥物，而是轉而分析一份已經獲批或用于其它用途的候選藥物清單，通過質譜流式檢測技術，單細胞測序技術等從候選清單中篩選出塞卡替尼，并評估塞卡替尼在動脈粥樣硬化中的抗炎作用。本研究所采用的這種系統免疫學驅動藥物的重定向與臨床前的驗證策略，有助于人類心血管疾病免疫療法的開發，也為抗炎藥物新用途的探索提供新思路。

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參考文獻：

Amadori, L., Calcagno, C., Fernandez, D.M. et al. Systems immunology-based drug repurposing framework to target inflammation in atherosclerosis. Nat Cardiovasc Res (2023). doi：10.1038/s44161-023-00278-y