患者來源的類器官組織（PDOs）是一種個性化的癌癥模型，可模仿母體腫瘤對化療的反應，有幾項研究提出將 PDOs 作為藥物反應的個性化模型。PDO 可與基質細胞和免疫細胞共同培養，以再現腫瘤微環境（ TME） 的主要特征，但這如何改變 PDO 表型和藥物反應機制尚不清楚。此外，PDO 對藥物的敏感性通常是通過總的細胞存活率來測量的，這種方法無法解析共培養中的細胞類型特異性，也無法從機理上深入了解藥物反應。
為了克服這些困難，倫敦大學學院癌癥研究所的研究者利用Standard BioTools公司的質譜流式（CyTOF®）多參數，低背景，無熒光串色，數據質量高等技術優勢，于前期研究中開發了一種多參數的巰基反應類有機體原位編碼（TOBis）質譜流式（CyTOF®）平臺，用于結直腸癌（CRC）類器官樣本的研究，能夠實現對類器官樣本的原位混樣并進行質譜流式（CyTOF®）檢測，從而克服類器官研究中，組別多，樣本量少，難以對翻譯后修飾（PTM）信號檢測的限制。[1] 而在2023年11月發表在《Cell》雜志上的《Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses》這篇文章，這個實驗室進一步利用前期建立的TOBis質譜流式（CyTOF®）平臺深入解析了抗癌藥物如何調節 CRC PDOs 的PTM信號傳導和細胞狀態。[2]
圖1. 用TOBis質譜流式（CyTOF®）檢測類器官的細胞類型和細胞狀態的實驗流程?！?】
為了研究腫瘤相關成纖維細胞（CAFs） 如何調控患者特異性藥物反應信號，作者建立了一個高通量三維類器官共培養系統，該系統由 10 個單獨培養或與 CRC CAFs 共同培養的 CRC PDOs組成。類器官培養物一式三份，分別用5-氟尿嘧啶（5-FU）、SN-38（伊立替康的活性代謝物）、奧沙利鉑和西妥昔單抗（EGFR抑制劑）、LGK974（PORCN 抑制劑）、Berzosertib（VX-970）進行處理。樣本隨后進行TOBis質譜流式（CyTOF®）染色和檢測流程。作者設計了44個marker的CyTOF® panel，可識別細胞類型、細胞狀態、DNA 損傷和 PTM 信號轉導。最終作者從 2,520 個三維培養物中獲得了超過 1,000 萬個 PDO 細胞和超過 1,500 萬個 CAFs（3,360 個細胞類型特異性的PDO+CAF單細胞信號數據集）。
圖2. TOBis 質譜流式（CyTOF®）進行單細胞 PTM PDO-CAF 藥物篩選的方案和流程
由于涉及到三千多個單細胞數據集的挑戰，作者還開發了新的質譜流式（CyTOF®）數據分析方法Trellis，能夠將處理與配對的對照樣本嵌入樹狀結構并進行可視化。作者使用配對 Trellis 分析了 3,360 個（1,680 個 PDO、1,680 個 CAF）單細胞 PTM 圖譜（>2,500 萬個單細胞），探索了 PDO和 CAF的藥物、患者和微環境特異性治療反應。發現PDOs表現出明顯的患者和微環境特異性藥物反應，但CAF信號傳導并未因患者或藥物而聚集，這表明化療主要改變了PDOs而非CAFs的細胞狀態、DNA損傷和PTM圖譜。
圖3. Trellis：基于樹狀結構的單細胞治療效果分析
圖4. 對單細胞 PDO-CAF 藥物反應的 Trellis 分析
(B) PDO 藥物治療特異性反應。左側為配對組相對應的對照組，在 PHATE 1 上評估治療效果，在 PHATE 2上評估響應機制。
(C)患者特異性藥物反應解釋了不同的化療敏感機制和化療難治性患者。
(D)CAFs可為患者提供特異性的5-FU、SN-38和奧沙利鉑化療保護。
同時，作者還利用質譜流式（CyTOF®）多參數檢測的特點，能夠同時對細胞的凋亡，增殖，DNA損傷等多種細胞狀態進行分析，替代了傳統藥物篩選中單純以細胞活死評估藥效的檢測方法，可以檢測到不會導致細胞死亡的靶向治療效果。分析的結果顯示化療在幾乎所有 PDO 中都顯示出靶向有絲分裂停滯（83%），但只有一部分患者和治療組合會引發細胞凋亡（40%）。這表明靶向藥物反應在 CRC PDO 中很常見，但往往不足以誘導細胞死亡。因此作者進一步分析了化療敏感型和化療難治型PDO的特征。發現與化療敏感性患者相比，即使化療難治性 PDO 也會出現靶向藥物反應，通常引起較低的雙鏈斷裂反應，不會激活 PARP 或 Caspase-3，這意味著藥物誘導的細胞抑制應激無法引發廣泛的 DNA 損傷和細胞凋亡?；熾y治型PDO通常具有高水平的細胞內 pSMAD2/3、pSMAD1/5/9、pMKK4、pBAD、pBTK 和 pNF-κB 信號傳導，這些通路與化療難治型細胞狀態有關?？傊?，TOBis質譜流式（CyTOF®）和Trellis分析顯示，靶向藥物活性在CRC PDO中很常見（甚至在化療難治性PDO中），但細胞毒性是患者特異性的，與細胞內在的PDO細胞狀態和PTM信號相關。
圖5. PDO 藥物反應機制針對特定患者，與細胞內在狀態和 PTM 信號相一致
(B) 在藥物治療過程中，Trellis分析中細胞的特異性分布揭示了靶細胞狀態的變化。
(E) 細胞內源性 PTM 信號轉導節點的 TreEMD-PHATE 顯示 PTM 在化療難治性 PDO 中上調。
為了從功能上探索 CAFs 在患者特異性 CRC PDO 藥物反應中的作用，作者對藥物治療后的 PDO 單培養物和 PDO-CAF 共培養物進行了并行 Trellis 分析；Trellis 顯示，CAFs 能以患者和藥物特異性的方式提供不同程度的化學保護。CAFs 可以快速調節 PDOs 中的 PTM 信號網絡，并使以前對化學藥物敏感的癌細胞向新的難化療細胞命運轉變。
圖6. CAF對PDO 21 和 PDO 27 中的PTM 信號網絡的調控。CAF 下調受保護 PDO 中的 MAPK 和 PI3K 通路，上調 SMAD、 NF-κB 和 BAD 信號轉導節點。
本實驗室同時間發表在《Cell》雜志上的《An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization》（詳見：《【Cell】-質譜流式揭示結腸干細胞極化表型》）中表明，結腸干細胞存在于一個連續的可塑性景觀中，從增殖性結腸干細胞（proCSCs）到緩慢循環的復活結腸干細胞（revCSCs）。[3] 結合前期的數據結果，作者同樣發現細胞間CAF信號傳導能以患者特異性的方式驅動proCSC向revCSC的細胞命運轉變，從而保護癌細胞免受化療。
總之，作者利用Standard BioTools質譜流式（CyTOF®）的技術優勢，開發出TOBis混樣質譜流式（CyTOF®）檢測平臺，實現了高參數的類器官單細胞 PTM 圖譜分析和基于Trellis分析方法的治療效果分析，揭示了成千上萬個PDO-CAF培養物中患者特異性的藥物反應，為研究異質性藥物反應機制提供了新的機會。
參考文獻：
[1]Qin X, Sufi J, Vlckova P, et al. Cell-type-specific signaling networks in heterocellular organoids. Nat Methods. 2020;17(3):335-342. doi:10.1038/s41592-020-0737-8
[2]Ramos Zapatero M, Tong A, Opzoomer JW, et al. Trellis tree-based analysis reveals stromal regulation of patient-derived organoid drug responses. Cell. 2023;186(25):5606-5619.e24. doi:10.1016/j.cell.2023.11.005
[3] Qin X, Cardoso Rodriguez F, Sufi J, Vlckova P, Claus J, Tape CJ. An oncogenic phenoscape of colonic stem cell polarization. Cell. 2023;186(25):5554-5568.e18. doi:10.1016/j.cell.2023.11.004