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藥物濫用（如可卡因、阿片類藥物）最初會帶來急性獎賞效應，即藥物的正性強化效應，用藥后導致大腦功能的適應性變化，且這種快感驅使個體進一步攝取藥物；停藥后個體會產生不適的身體反應以及煩躁、抑郁、易怒、焦慮等負面情緒。個體為了緩解這種不適會進一步獲藥，即負性強化效應。正性強化和負性強化的循環交替促進藥物依賴的狀態。嗎啡（morphine）是阿片類藥物的一種。其衍生物鹽酸嗎啡是臨床上最常用的鎮痛劑，有極強的鎮痛作用。然而，嗎啡具有易成癮這一危害極深的副作用。長期使用嗎啡的患者會產生嚴重的依賴性，如果停止用藥一段時間，會產生焦慮、抑郁等戒斷反應。這些戒斷反應會驅使患者使用更多嗎啡，形成惡性循環，嚴重危害了公共健康。藥物從最初獎賞過渡到藥物依賴的過程伴隨著大腦神經環路可塑性的改變，中腦邊緣系統的重要腦區腹側被蓋區（ventral tegmental area, VTA）神經元可塑性參與調控阿片類藥物依賴和戒斷癥狀[1,2]，然而，目前尚不清楚影響獎賞的正性強化和戒斷誘發的負性強化之間轉換的神經環路重塑機制。近日，復旦大學腦科學研究院馬蘭/王菲菲團隊在Molecular Psychiatry發表題為CRHCeA→VTA inputs inhibit the positive ensembles to induce negative affect of opiate withdrawal的最新研究工作[3]。該研究借助即早基因驅動的標記技術標記了VTA中嗎啡激活的獎賞神經元集群（嗎啡神經元集群），發現中央杏仁核（central amygdala, CeA）中促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）神經元通過抑制性環路調控VTA嗎啡神經元集群，并介導嗎啡戒斷誘發的負性強化效應，闡明了成癮性藥物嗎啡負性強化環路和分子機制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預靶點，具有重要科學和社會意義。
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1.VTA嗎啡神經元集群以多巴胺依賴機制介導正性強化
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首先，研究人員借助響應神經元活性的功能元件--E-SARE（synaptic activity-response elements， AAV-E-SARE-CreERT2）標記中腦邊緣系統的重要腦區腹側被蓋區（ventral tegmental area, VTA）嗎啡初次暴露激活的神經元集群（Mor-Ens, 嗎啡神經元集群），發現VTA嗎啡神經元集群偏向性地投射到伏隔核（the nucleus accumbens, NAc）腦區（圖1a-f）。
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隨后，研究人員在小鼠VTA區注射AAV-E-SARE-CreERT2和AAV-DIO-hChR2-mCherry混合病毒并埋入光纖，借助顱內自身刺激（intracranial self-stimulation, ICSS）系統發現，光激活VTA嗎啡神經元集群可引起小鼠鼻觸反應次數增加，使用氟哌噻醇（flupenthixol 多巴胺拮抗劑）可抑制這一現象（圖1g-j）。同時，借助DA探針發現激活VTA嗎啡神經元集群能夠促進NAc多巴胺的釋放（圖1k-o）。上述結果提示了VTA嗎啡神經元集群偏向性地投射到伏隔核（NAc）腦區，激活VTA嗎啡神經元集群能夠促進NAc多巴胺的釋放，引發小鼠的自給光行為，介導了多巴胺依賴的正性強化效應。
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圖1 VTA嗎啡神經元集群以多巴胺依賴機制介導正性強化
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2.VTA嗎啡神經元集群接收的抑制性輸入增強，介導戒斷誘發的負性強化
接下來，借助全細胞膜片鉗記錄發現，在慢性嗎啡暴露條件下，TH陽性VTA嗎啡神經元集群的mIPSC振幅和頻率顯著增加，提示了VTA多巴胺能嗎啡神經元集群接受更多的抑制性輸入（圖2a-i）。
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隨后，借助化學遺傳學技術和行為學范式發現，hM4Di抑制VTA嗎啡神經元活性會加重嗎啡戒斷誘發的條件位置厭惡和焦慮行為，而hM3Dq激活嗎啡神經元集群能夠緩解嗎啡戒斷帶來的厭惡和焦慮負性情緒（圖2j-w），提示了編碼嗎啡獎賞的正性神經元集群功能受到抑制，是導致嗎啡負性強化的原因。
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圖2 VTA嗎啡神經元集群接收的抑制性輸入增強，介導戒斷誘發的負性強化
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3.激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發負性情緒
研究發現，促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）參與戒斷期間相關行為，研究人員在CRH-Cre鼠VTA區注射 AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP，標記在中央杏仁核（central amygdala, CeA）、終紋床核（bed nucleus of stria terminalis, BNST）和下丘腦室旁核（paraventricular nucleus of the hypothalamus, PVN）投射到VTA的CRH神經元。慢性嗎啡處理后，CRHCeA→VTA和CRHBNST→VTA神經元中c-Fos表達增加（圖3a-c）。
CeA是杏仁體主要的抑制性輸出部位，參與情緒加工[4-6]。因此，研究人員借助逆行示蹤病毒和電生理技術發現，嗎啡慢性給藥治療增加了CRHCeA→VTA神經元mEPSC振幅和頻率，提高了神經元興奮性(圖3d-j)。隨后，研究人員在CRH-Cre鼠CeA區注射Cre依賴的光遺傳學病毒，并在VTA埋入光纖，借助條件性位置厭惡（conditioned place aversion, CPA）、高架十字迷宮（elevated-plus maze, EPM）和曠場實驗（open-field, OFT）行為學范式發現，AAV-DIO-eNpHR3.0抑制CRHCeA→VTA投射通路可緩解嗎啡戒斷誘發的焦慮和厭惡負面情緒（3k-p），AAV-DIO-hChR2激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發負性情緒（3q-v）。
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圖3 激活CRHCeA→VTA投射通路可加重嗎啡戒斷誘發負性情緒
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4.慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經環路重塑
進一步，研究人員在CRH-Cre鼠VTA注射AAV-Retro-EF1a-DIO-EYFP和AAV-Retro-hSyn-tdTomato病毒，c-Fos共標統計發現嗎啡慢性給藥增加了CeA腦區c-Fos+CRH+神經元的比例（圖4a-c），提示了嗎啡慢性給藥對CRHCeA→VTA神經元活性有特異性調節作用。
為研究CeA到嗎啡神經元集群（Mor-Ens）的單突觸輸入，作者借助E-SARE元件和逆向跨突觸病毒系統標記VTA輸入神經元，并用熒光探針技術發現CeA crh陽性神經元偏向性地與嗎啡神經元集群形成突觸連接（圖4d-g）。接下來，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-mCherry，VTA區注射AAV-RAM-tTA-TRE-EGFP，借助Dox標記體系和光遺傳學技術發現，嗎啡慢性給藥促使CeA中CRH神經元向VTA多巴胺能嗎啡神經元集群的抑制性連接增強（圖4h-s）。
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圖4 慢性嗎啡給藥參與CRHCeA→VTA神經環路重塑
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5.CRHCeA→VTA通路介導嗎啡戒斷誘發的厭惡和焦慮等負面情緒的產生
隨后，研究人員借助RAM-tTA-TRE/DOX系統做進一步驗證，他們在CRH-Cre小鼠VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，CNO激活VTA嗎啡神經元集群導致了小鼠焦慮樣行為（圖5a-e），這與E-SARE-CreERT2TAM系統得到的結果一致。為觀察VTA嗎啡神經元集群的激活是否能緩解由CRHCeA→VTA連接增強引起負性情緒，研究人員在CRH-Cre小鼠CeA注射AAV-DIO-hChR2-EYFP，VTA注射AAV-RAM-tTA-TRE-hM3Dq病毒，借助CPA和EPM行為學范式發現，光遺傳激活CRHCeA→VTA通路導致的小鼠表現出條件性位置厭惡，同時進入開放臂的次數減少，表現出焦慮樣行為，而化學遺傳激活VTA嗎啡神經元集群則有效改善了這一現象（圖5f-j）。
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圖5 CRHCeA→VTA通路介導嗎啡戒斷誘發的厭惡和焦慮等負性情緒的產生
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6.嗎啡神經元集群的CRHR1受體介導CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發的負性情緒
由于光刺激可能觸發神經元末梢的神經肽釋放[7]。研究人員對CRH受體信號在CeA中CRH神經元向VTA嗎啡神經元集群抑制性輸入通路的潛在作用做進一步研究。他們在VTA離體腦片做光遺傳操作和電生理記錄，發現CRHR1受體拮抗劑可顯著降低VTA嗎啡神經元集群O-IPSCs（optical-evoked inhibitory postsynaptic currents, 光誘發抑制性突觸后電流）的振幅和頻率，提示了CRHR1受體介導了CRH信號參與嗎啡神經元集群的抑制性輸入，揭示了CRH信號通路在CeA CRH神經元到VTA嗎啡神經元集群投射通路可塑性重塑中的重要作用（圖6a-f）。最后，研究人員探究這種神經環路的重塑涉及的具體分子機制，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術下調CRHR1的表達，在小鼠VTA區注射AAV-sgCrhr1-mcherry, AAV-RAM-tTA-TRE-Cre和AAV-DIO-saCas9病毒，單分子熒光原位雜交技術（smFISH）發現，VTA嗎啡神經元集群中Crhr1 mRNA表達顯著下調（圖6g-i）。同時，行為學范式結果發現，CRHR1缺失對于小鼠嗎啡戒斷時期的條件性位置厭惡、自發活動以及糖水偏好行為無明顯變化，但是增加了小鼠進入開放臂的次數、懸尾實驗（TST）中小鼠掙扎時間以及社交評分，提示了VTA嗎啡神經元集群中CRHR1參與嗎啡戒斷時期包括焦慮、抑郁、社交能力下降等負性情緒的發展（圖6j-p）。此外，在CRH-Cre小鼠注射光遺傳病毒及RAM/DOX系統介導的CRISPR病毒發現，抑制嗎啡神經元集群上的CRHR1受體顯著降低O-IPSC振幅，提示了下調CRHR1受體的表達，能顯著減弱CeA CRH神經元到VTA嗎啡神經元集群的抑制性輸入（圖6q-s）。綜上，CRHR1受體參與CeA CRH神經元到VTA嗎啡神經元集群的抑制性輸入環路的突觸和功能重塑，介導了嗎啡戒斷誘發的負性強化。
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圖6 嗎啡神經元集群的CRHR1受體介導CRHCeA→VTA的抑制性輸入，參與嗎啡戒斷誘發的負性情緒
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本文中，作者首先借助即早基因驅動的標記技術標記了VTA中嗎啡初次暴露激活的獎賞神經元集群（嗎啡神經元集群），隨后，借助病毒載體示蹤技術、光遺傳學技術、化學遺傳學技術、神經遞質探針、電生理記錄、熒光原位雜交、行為學實驗等多種技術手段，發現VTA嗎啡神經元集群選擇性地投射到NAc，通過多巴胺依賴機制介導正性強化效應，抑制這類神經元集群，會導致戒斷誘發的負性強化效應。進一步研究發現，在嗎啡慢性給藥后，CeA腦區CRH神經元與VTA嗎啡神經元集群的抑制性突觸連接增強，從而介導了嗎啡戒斷誘發的厭惡和焦慮等負性情緒的產生。最后，借助CRISPR/Cas9基因編輯技術下調嗎啡神經元集群上的CRHR1受體的表達可減弱CRHCeA→VTA的抑制性輸入，緩解嗎啡戒斷誘發的負面情緒。該研究闡明了成癮性藥物嗎啡負性強化環路和分子機制，為治療成癮、防止藥物濫用提供新的干預靶點，具有重要科學和社會意義。復旦大學腦科學研究院博士后江長優為本文的第一作者，基礎醫學院博士研究生楊霄和何觀虹為本文的共同第一作者。腦科學研究院的馬蘭教授與王菲菲教授為本文的通訊作者。本文的合作者還有來自復旦大學附屬華山醫院的毛穎教授和徐文東教授。
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