這篇推文之前推過，讀者提出了一些問題，重新修改了再次發出。
單克隆抗體技術日新月異，比如，單B技術啊,噬菌體展示庫技術，但是小鼠雜交瘤技術因其簡單易操，便于實施，目前還是單抗研發的主流技術。
篩選到陽性細胞株后，傳統的生產單克隆抗體方法是將單克隆細胞株擴繁之后，注入Balb/c小鼠腹腔內產生腹水，最后從腹水中純化得到單克隆抗體。這種生產單克隆抗體方法有很多弊端：1.周期長，通常需要三到四周左右的時間，細胞擴繁到可以注射到小鼠體內（每只小鼠需要10^5個細胞）通常需要3~5個天，細胞生長至小鼠腹腔內產生腹水通常需要1~2周，何況有的細胞株在小鼠體內形成實體瘤，根本就不產腹水；2.腹腔注射腹水法需要使用大量的Balb/c小鼠，在其體內注射瘤細胞，有點殘忍，不符合動物福利。3.腹腔內腹水法生產單克隆抗體，受動物個體影響也很大，另外，最終純化得到的抗體含有動物源蛋白成份污染的可能。
為什么要把細胞株馴化成無血清培養呢，直接用現有含血清培養基放大培養產抗體不行么？含牛血清的細胞培養上清里面含有大量的牛免疫球蛋白，會干擾從細胞培養液上清純化單克隆抗體，其抗體產量也不高。無血清培養基在搖瓶中培養經過馴化的細胞，密度可以達到10^7/ml以上甚至達到10^8/ml，抗體產量自然大大提高，抗體下游純化不受動物成分干擾。
多年以來我一直在苦苦求索合適的雜交瘤無血清培養基產品。2018年，我問過幾個做培養基的朋友，他們說目前生產的雜交瘤培養基，還是需要加入少量的血清，還沒辦法做到完全的無血清。
曾經也求助于做過小鼠雜交瘤細胞無血清馴化的朋友，他給了我一瓶北京某公司生產的雜交瘤細胞無血清培養基讓我自己試，并且告訴我在他們的實驗數據中，有很多細胞珠在馴化的最后一步斷血清的時候還是會死掉的。我把這個培養基拿回來測試了一下，正如他所說的那樣，每次培養到血清0.5%的時候，細胞就開始死亡了。
不到黃河不死心，一旦有這方面的信息，我還是想再試試。于是又從北京和上海的兩個廠家購買了雜交瘤無血清培養基回來測試，每次都是到了血清0.5%的時候，細胞就開始死亡了。
雜交瘤細胞無血清馴化這事只能擱淺，但始終是一個疙瘩埋在我的心里。
今年3月份，在蘇州的一個展會上認識了珠海凱瑞楊經理，他們是做無血清培養基的，在展會現場，我們并沒有談及此事，只記得好像很久以前買過他們的293培養基。8月初，蘇州的思格生物任總和愷瑞楊經理來武漢出差，有機會向任總請教了雜交瘤無血清馴化的問題。任總的不吝賜教，讓我再次燃起了雜交瘤細胞無血清馴化的希望。任總告訴我，他們所用的雜交流無血清培養基是愷瑞的。
8月份，我們手上正好有幾株在養的雜交瘤細胞株。于是我就向楊經理申請了試用裝。對于感興趣的產品，如果廠家沒有試用裝，自掏腰包購買我也愿意嘗試。一個企業生產流程的建立，原料的來源和篩選是其中最重要的一環，好的產品是在幫你。有時候，我倒是有點憎惡那種到處要試用裝的人，有的拿了試用裝，往冰箱一扔，根本不測試；或者，測試了之后，他的實驗也做完了，壓根懶得理你。
拿到培養基試用裝，我立即選了幾株雜交瘤細胞開始了馴化實驗測試。
根據任總給的馴化流程，我選擇在24孔板里馴化，并稍微修改了馴化流程：將雜交瘤細胞培養至24孔板內，細胞貼壁后，馴化過程基本步驟如下：細胞培養孔中置換為無血清培養基（含1% 100X ITSplus 因子和10%胎牛血清）培養，根據細胞生長的速度換液，每次換液將血清減半，依次為10%-5%-2.5%-1.25%-0，最后擴大培養到T75細胞培養瓶，置換新鮮的無血清培養基（含1% 100X ITSplus 因子），按10^6/ml的密度轉入搖瓶培養，90rpm。
之前所有的失敗案例，我都是在搖瓶中馴化，這次任總特意強調，馴化過程要靜置培養，搖晃對細胞損傷比較大，我之前的思想誤區一直認為搖晃起來讓細胞更好地接觸到新鮮培養基和空氣環境，更利于生長。
這次很幸運，幾株細胞都平穩馴化到無血清搖瓶培養狀態，整個周期下來一周多時間。
這次馴化雖然是成功了，但是我覺得周期還是有點長。于是我設計了這樣一個方案：將原培養基培養的雜交瘤細胞，吹打懸浮離心后，用無血清培養基（含1% 100X ITSplus 因子 ）重懸，分種到24孔板孔內，每孔10^5個細胞，然后再梯度加入血清，使其終濃度依次為10%-5%-2.5%-1.25%-0.5%-0。培養24小時后，保留細胞形態良好，抗體分泌能力正常的，血清含量最低濃度細胞培養孔繼續培養穩定傳代2次，再按照上述思路繼續減少血清馴化，直至馴化到無血清。這個思路的優勢是可以快速找到雜交瘤細胞的最低血清耐受點，比之前按部就班減血清的方法更節約時間。這樣馴化周期至少可以縮短一半，同時更節約培養基。
以上兩種方案都是我們自己琢磨的使用方法，那么生產廠家的標準指導步驟是什么呢？我這個人性子急，拿到產品，不管是產品還是試劑，直接上手就開搞，除非搞不明白了再去扒拉說明書。這一次不同，我們是“自學成才”，再回頭看廠家是怎么教我們解鎖新技能呢？
我之前也沒有在意試用裝產品里有沒有紙質說明書。于是給楊經理發了微信要了電子版說明書。
這里與任總說的不一樣：廠家是建議用搖瓶。另外，已經馴化到別廠家無血清培養基的細胞株，這里是一下子直接適應不過，還是說把它按照有血清培養細胞株對待，用減血清方法馴化不過來呢？
這個馴化過程的說明，這里有點沒看明白：劃紅線第一句話的意思是不是將雜交瘤細胞在原培養基中擴增培養？第二句“用力拍打瓶身”，這個不好把握，用多大的力？我用專業的細胞培養吸管吹起讓其懸浮，細胞它難道會跳起來咬人？
馴化到無血清培養基的細胞基本就開始“飄”了，有的成團，像青蛙卵，有的像一粒一粒晶瑩剔透的珍珠，細胞形狀和大小也不一。手機直接對著顯微鏡拍的，圖像不太好看。
至于抗體的產量，這里就不寫了，因為每株細胞產生抗體能力不一樣，何況我剛剛開始入手，手上的案例較少，數據沒有說服力。
昨天晚上與一個做抗體的吳總吃飯，我推薦他用無血清培養生產單抗，他是抗拒的，一方面他覺得成本高，另一方面，還是擔心無血清馴化的過程中細胞株會退化，生產的抗體性能上比腹水法弱。
吳總擔心的問題其實是很多做單抗生產的人都擔心的問題，上次賈總也擔心這個問題。其實，成本嘛，可以跟廠家談，培養基的生產成本應該不是很高。至于細胞退化的問題，只要定期做好抗體效價監測和抗體驗證，應該問題也不大。對于科研用戶我是強烈推薦用無血清馴化雜交瘤細胞法生產單克隆抗體，節約時間，科研對于抗體的需求量較少，絕對比小鼠腹腔產腹水法更節約成本。
關于雜交瘤無血清馴化問題，歡迎交流，微信號：frdbio;也歡迎推薦分享更好更質優價廉的無血清培養基。