這篇推文之前推過，讀者提出了一些問題，重新修改了再次發(fā)出。
單克隆抗體技術(shù)日新月異，比如，單B技術(shù)啊,噬菌體展示庫技術(shù)，但是小鼠雜交瘤技術(shù)因其簡單易操，便于實施，目前還是單抗研發(fā)的主流技術(shù)。
篩選到陽性細胞株后，傳統(tǒng)的生產(chǎn)單克隆抗體方法是將單克隆細胞株擴繁之后，注入Balb/c小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生腹水，最后從腹水中純化得到單克隆抗體。這種生產(chǎn)單克隆抗體方法有很多弊端：1.周期長，通常需要三到四周左右的時間，細胞擴繁到可以注射到小鼠體內(nèi)（每只小鼠需要10^5個細胞）通常需要3~5個天，細胞生長至小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生腹水通常需要1~2周，何況有的細胞株在小鼠體內(nèi)形成實體瘤，根本就不產(chǎn)腹水；2.腹腔注射腹水法需要使用大量的Balb/c小鼠，在其體內(nèi)注射瘤細胞，有點殘忍，不符合動物福利。3.腹腔內(nèi)腹水法生產(chǎn)單克隆抗體，受動物個體影響也很大，另外，最終純化得到的抗體含有動物源蛋白成份污染的可能。
為什么要把細胞株馴化成無血清培養(yǎng)呢，直接用現(xiàn)有含血清培養(yǎng)基放大培養(yǎng)產(chǎn)抗體不行么？含牛血清的細胞培養(yǎng)上清里面含有大量的牛免疫球蛋白，會干擾從細胞培養(yǎng)液上清純化單克隆抗體，其抗體產(chǎn)量也不高。無血清培養(yǎng)基在搖瓶中培養(yǎng)經(jīng)過馴化的細胞，密度可以達到10^7/ml以上甚至達到10^8/ml，抗體產(chǎn)量自然大大提高，抗體下游純化不受動物成分干擾。
多年以來我一直在苦苦求索合適的雜交瘤無血清培養(yǎng)基產(chǎn)品。2018年，我問過幾個做培養(yǎng)基的朋友，他們說目前生產(chǎn)的雜交瘤培養(yǎng)基，還是需要加入少量的血清，還沒辦法做到完全的無血清。
曾經(jīng)也求助于做過小鼠雜交瘤細胞無血清馴化的朋友，他給了我一瓶北京某公司生產(chǎn)的雜交瘤細胞無血清培養(yǎng)基讓我自己試，并且告訴我在他們的實驗數(shù)據(jù)中，有很多細胞珠在馴化的最后一步斷血清的時候還是會死掉的。我把這個培養(yǎng)基拿回來測試了一下，正如他所說的那樣，每次培養(yǎng)到血清0.5%的時候，細胞就開始死亡了。
不到黃河不死心，一旦有這方面的信息，我還是想再試試。于是又從北京和上海的兩個廠家購買了雜交瘤無血清培養(yǎng)基回來測試，每次都是到了血清0.5%的時候，細胞就開始死亡了。
雜交瘤細胞無血清馴化這事只能擱淺，但始終是一個疙瘩埋在我的心里。
今年3月份，在蘇州的一個展會上認識了珠海凱瑞楊經(jīng)理，他們是做無血清培養(yǎng)基的，在展會現(xiàn)場，我們并沒有談及此事，只記得好像很久以前買過他們的293培養(yǎng)基。8月初，蘇州的思格生物任總和愷瑞楊經(jīng)理來武漢出差，有機會向任總請教了雜交瘤無血清馴化的問題。任總的不吝賜教，讓我再次燃起了雜交瘤細胞無血清馴化的希望。任總告訴我，他們所用的雜交流無血清培養(yǎng)基是愷瑞的。
8月份，我們手上正好有幾株在養(yǎng)的雜交瘤細胞株。于是我就向楊經(jīng)理申請了試用裝。對于感興趣的產(chǎn)品，如果廠家沒有試用裝，自掏腰包購買我也愿意嘗試。一個企業(yè)生產(chǎn)流程的建立，原料的來源和篩選是其中最重要的一環(huán)，好的產(chǎn)品是在幫你。有時候，我倒是有點憎惡那種到處要試用裝的人，有的拿了試用裝，往冰箱一扔，根本不測試；或者，測試了之后，他的實驗也做完了，壓根懶得理你。
拿到培養(yǎng)基試用裝，我立即選了幾株雜交瘤細胞開始了馴化實驗測試。
根據(jù)任總給的馴化流程，我選擇在24孔板里馴化，并稍微修改了馴化流程：將雜交瘤細胞培養(yǎng)至24孔板內(nèi)，細胞貼壁后，馴化過程基本步驟如下：細胞培養(yǎng)孔中置換為無血清培養(yǎng)基（含1% 100X ITSplus 因子和10%胎牛血清）培養(yǎng)，根據(jù)細胞生長的速度換液，每次換液將血清減半，依次為10%-5%-2.5%-1.25%-0，最后擴大培養(yǎng)到T75細胞培養(yǎng)瓶，置換新鮮的無血清培養(yǎng)基（含1% 100X ITSplus 因子），按10^6/ml的密度轉(zhuǎn)入搖瓶培養(yǎng)，90rpm。
之前所有的失敗案例，我都是在搖瓶中馴化，這次任總特意強調(diào)，馴化過程要靜置培養(yǎng)，搖晃對細胞損傷比較大，我之前的思想誤區(qū)一直認為搖晃起來讓細胞更好地接觸到新鮮培養(yǎng)基和空氣環(huán)境，更利于生長。
這次很幸運，幾株細胞都平穩(wěn)馴化到無血清搖瓶培養(yǎng)狀態(tài)，整個周期下來一周多時間。
這次馴化雖然是成功了，但是我覺得周期還是有點長。于是我設(shè)計了這樣一個方案：將原培養(yǎng)基培養(yǎng)的雜交瘤細胞，吹打懸浮離心后，用無血清培養(yǎng)基（含1% 100X ITSplus 因子 ）重懸，分種到24孔板孔內(nèi)，每孔10^5個細胞，然后再梯度加入血清，使其終濃度依次為10%-5%-2.5%-1.25%-0.5%-0。培養(yǎng)24小時后，保留細胞形態(tài)良好，抗體分泌能力正常的，血清含量最低濃度細胞培養(yǎng)孔繼續(xù)培養(yǎng)穩(wěn)定傳代2次，再按照上述思路繼續(xù)減少血清馴化，直至馴化到無血清。這個思路的優(yōu)勢是可以快速找到雜交瘤細胞的最低血清耐受點，比之前按部就班減血清的方法更節(jié)約時間。這樣馴化周期至少可以縮短一半，同時更節(jié)約培養(yǎng)基。
以上兩種方案都是我們自己琢磨的使用方法，那么生產(chǎn)廠家的標準指導步驟是什么呢？我這個人性子急，拿到產(chǎn)品，不管是產(chǎn)品還是試劑，直接上手就開搞，除非搞不明白了再去扒拉說明書。這一次不同，我們是“自學成才”，再回頭看廠家是怎么教我們解鎖新技能呢？
我之前也沒有在意試用裝產(chǎn)品里有沒有紙質(zhì)說明書。于是給楊經(jīng)理發(fā)了微信要了電子版說明書。
這里與任總說的不一樣：廠家是建議用搖瓶。另外，已經(jīng)馴化到別廠家無血清培養(yǎng)基的細胞株，這里是一下子直接適應不過，還是說把它按照有血清培養(yǎng)細胞株對待，用減血清方法馴化不過來呢？
這個馴化過程的說明，這里有點沒看明白：劃紅線第一句話的意思是不是將雜交瘤細胞在原培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)？第二句“用力拍打瓶身”，這個不好把握，用多大的力？我用專業(yè)的細胞培養(yǎng)吸管吹起讓其懸浮，細胞它難道會跳起來咬人？
馴化到無血清培養(yǎng)基的細胞基本就開始“飄”了，有的成團，像青蛙卵，有的像一粒一粒晶瑩剔透的珍珠，細胞形狀和大小也不一。手機直接對著顯微鏡拍的，圖像不太好看。
至于抗體的產(chǎn)量，這里就不寫了，因為每株細胞產(chǎn)生抗體能力不一樣，何況我剛剛開始入手，手上的案例較少，數(shù)據(jù)沒有說服力。
昨天晚上與一個做抗體的吳總吃飯，我推薦他用無血清培養(yǎng)生產(chǎn)單抗，他是抗拒的，一方面他覺得成本高，另一方面，還是擔心無血清馴化的過程中細胞株會退化，生產(chǎn)的抗體性能上比腹水法弱。
吳總擔心的問題其實是很多做單抗生產(chǎn)的人都擔心的問題，上次賈總也擔心這個問題。其實，成本嘛，可以跟廠家談，培養(yǎng)基的生產(chǎn)成本應該不是很高。至于細胞退化的問題，只要定期做好抗體效價監(jiān)測和抗體驗證，應該問題也不大。對于科研用戶我是強烈推薦用無血清馴化雜交瘤細胞法生產(chǎn)單克隆抗體，節(jié)約時間，科研對于抗體的需求量較少，絕對比小鼠腹腔產(chǎn)腹水法更節(jié)約成本。
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