siRNA（小干擾RNA）是一種新型的基因治療工具，是由21-25個(gè)核苷酸組成的雙鏈短RNA分子，能夠特異性地誘導(dǎo)靶基因的沉默，進(jìn)而抑制蛋白的表達(dá)。siRNA最初由Andrew Fire和Craig Melo在1998年提出，之后在2001年被證明可以特異性地抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的靶基因表達(dá)。這一發(fā)現(xiàn)由David Baulcombe團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志上發(fā)表，成為當(dāng)年全球十大科學(xué)進(jìn)展之首，他的團(tuán)隊(duì)并于2006年榮膺了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。
siRNA的抑制作用是通過其與AGO蛋白組裝成的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）發(fā)揮的。一條鏈被降解，另一條鏈則與靶基因的mRNA互補(bǔ)配對，使其被切割降解，從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的目的。與傳統(tǒng)的基因治療相比，siRNA具有高度特異性、快速、可逆性等優(yōu)點(diǎn)，可以應(yīng)用于各種真核生物的基因功能研究，藥靶發(fā)現(xiàn)及藥物篩選中廣泛應(yīng)用。例如siRNA靶向惡性腫瘤的基因可以通過局部或系統(tǒng)性給藥來治療腫瘤，病毒感染和遺傳疾病也都有涉及。
siRNA 抑制蛋白表達(dá)機(jī)制
為了方便使用，常規(guī)siRNA產(chǎn)品以凍干粉形式提供，可以直接用于各種細(xì)胞RNAi實(shí)驗(yàn)。科研人員可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)特定靶點(diǎn)，覆蓋人、小鼠、大鼠全基因組的所有基因。同時(shí)，通過對siRNA進(jìn)行化學(xué)修飾，可以提高其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的高效性、特異性和穩(wěn)定性。
RNA干擾（RNAi）是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，常常被用作基因沉默（基因干擾）的工具之一。siRNA作為RNAi的一種形式，具有非常廣闊的應(yīng)用前景。未來，siRNA還將繼續(xù)發(fā)揮其獨(dú)特的優(yōu)勢，成為治療相關(guān)疾病的新趨勢。
siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)介紹
01- siRNA儲(chǔ)存
常規(guī)化學(xué)合成的siRNA序列為21～23nt的雙鏈小分子RNA，為凍干粉形式的即用型試劑?，在常溫不溶解的情況下可以保存至少1個(gè)月時(shí)間，放置于-20℃～-80℃低溫環(huán)境中，凍干粉可以穩(wěn)定保存一年。
02- 轉(zhuǎn)染試劑儲(chǔ)存
4℃保存，不可冷凍。
03-體外轉(zhuǎn)染操作流程：
第一步、接種細(xì)胞：建議提前一天接種細(xì)胞，接種數(shù)量參考下方推薦量。
第二步、 轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：
● siRNA稀釋液配制：siRNA以水稀釋至140 μg/mL。
● siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液配制：取無菌離心管，加入2μL siRNA稀釋液，加入LipidnanoTM?Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑A液14μL，吹打混勻，加入LipidnanoTM?Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑B液4μL，混合均勻，室溫放置5min，加培養(yǎng)液180μL，吹打混勻。
第三步、細(xì)胞加樣：按下方推薦量將配制好的siRNA轉(zhuǎn)染復(fù)合液加入各細(xì)胞孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。
第四步、細(xì)胞培養(yǎng)：37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)，直至發(fā)揮干擾作用。建議24~48h測定mRNA水平、48~72h測定蛋白水平。
操作流程示例
siRNA樣品加入示例
注：使用本轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染時(shí)，為了獲得最佳基因沉默效果，每一種細(xì)胞系轉(zhuǎn)染siRNA的劑量都需要經(jīng)過實(shí)驗(yàn)確定最佳范圍。
示例中使用的體外轉(zhuǎn)染試劑為同立海源生產(chǎn)的LipidnanoTM?Super RNAi轉(zhuǎn)染試劑，主要應(yīng)用于：貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)染，部分原代細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞株的基因轉(zhuǎn)染，siRNA高通量轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。在進(jìn)行體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的過程中，實(shí)驗(yàn)還需注意這些細(xì)節(jié)：
??轉(zhuǎn)染前，確保siRNA是經(jīng)過PAGE純化和脫鹽處理過的，高純度的siRNA或者miRNA有助于獲得較高的轉(zhuǎn)染效率，并確保?siRNA/miRNA?基因沉默表達(dá)不會(huì)影響細(xì)胞活力。
??首次轉(zhuǎn)染：如果您是首次轉(zhuǎn)染您的細(xì)胞系，推薦嘗試使用幾個(gè)siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合液濃度，并在0.014μg/mL~0.70μg/mL范圍內(nèi)改變siRNA的濃度，根據(jù)首次轉(zhuǎn)染結(jié)果調(diào)整劑量水平。
??siRNA轉(zhuǎn)染試劑稀釋液的選擇：對培養(yǎng)基無特殊要求，可使用完全培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，不強(qiáng)要求減/無血清培養(yǎng)基。
??濃度換算：摩爾濃度與質(zhì)量濃度之間的換算關(guān)系可根據(jù)siRNA分子量可進(jìn)行同步換算。X nmol/L*分子量=Y ng/L，如分子量為14000的siRNA，1nmol/L*14000=14000ng/L=14μg/L。
??轉(zhuǎn)染細(xì)胞密度：推薦在70％左右時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。通常基因沉默的分析要在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)進(jìn)行。本轉(zhuǎn)染試劑極低的細(xì)胞毒性可以方便研究者根據(jù)目的細(xì)胞生長特性，靶基因的表達(dá)特性，選擇適合條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。健康的細(xì)胞培養(yǎng)物和嚴(yán)格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性。通常健康的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高，較低的傳代數(shù)能確保每次實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞的穩(wěn)定性。推薦用50代以下的細(xì)胞轉(zhuǎn)染。?
??陽性對照選擇：通過合適的陽性對照、實(shí)驗(yàn)siRNA優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件，對大多數(shù)細(xì)胞，GADPH-siRNA是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照
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