忙活大半天，地鼠處死了，腎臟取出來了，剪刀剪了半天，消化也做了——結果呢？細胞沒貼壁，或者貼壁的全是成纖維細胞，再或者一夜之間培養皿里漂著一層白毛。
原代腎實質細胞提取，翻車的方式遠比成功的方式多。
酶解時間差兩分鐘，細胞活性掉一半；離心轉速沒算對，想要的細胞全丟了；培養基少加一樣因子，目的細胞根本不長。更別提雜細胞污染這個老大難——成纖維細胞貼著貼著就把腎小管上皮細胞擠沒了。
這份原代地鼠腎實質細胞分離提取及培養Protocol，正是針對這些高頻翻車點來的。從組織離體到細胞貼壁，把消化時間、離心參數、培養基配方、雜細胞控制這些關鍵環節的參數和操作邏輯全部拆解清楚。照著做，至少能幫你避開80%的坑。
1. 實驗目的
高效分離、提取健康地鼠的腎實質細胞（主要為腎小管上皮細胞、腎小球系膜細胞等），建立穩定的原代培養體系，獲得高活性、高純度的腎實質細胞，為后續細胞生物學實驗、血清篩選等研究提供合格的細胞材料。
2. 實驗原理
利用機械分離結合酶解消化法，打破地鼠腎臟組織的細胞間連接（如膠原纖維、細胞黏附分子等），釋放單個腎實質細胞；通過差速離心去除雜質、紅細胞及破碎細胞，保留活性完整的腎實質細胞；在適宜的培養條件（特定培養基、溫度、氣體環境）下，模擬體內生理環境，使腎實質細胞貼壁生長、增殖，維持其原代細胞特性。
關鍵要點：嚴格控制酶解時間和溫度，避免過度消化損傷細胞活性；選擇適配腎實質細胞的培養基，添加必要的生長因子和血清，抑制成纖維細胞等雜細胞過度生長，提高細胞純度。
3. 實驗材料與儀器
3.1 實驗動物
健康SPF級地鼠，1-2周齡（幼鼠腎組織活力高、細胞增殖能力強，雜細胞污染少），雌雄不限，體重5-10g；實驗前禁食12h，自由飲水，適應性飼養1-2d。
3.2 試劑耗材（無菌級）
（1）基礎培養基：DMEM/F12培養基（1:1），不含血清和抗生素；
（2）消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（胰蛋白酶終濃度0.25%，EDTA終濃度0.02%），提前37℃預熱；
（3）終止液：含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養基，提前37℃預熱；
（4）清洗液：PBS緩沖液（pH7.2-7.4），添加青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL），高壓蒸汽滅菌后4℃保存；
（5）完全培養基：DMEM/F12培養基（1:1）+ 10% FBS + 1%雙抗（青霉素100U/mL+鏈霉素100ug/mL）+ 0.1%胰島素轉鐵蛋白硒（ITS）+ 10ng/mL表皮生長因子（EGF），過濾除菌后4℃保存，現配現用；
（6）其他試劑：75%乙醇（無菌）、0.22μm濾器、臺盼藍染色液（0.4%）；
（7）無菌耗材：培養皿（60mm/100mm）、離心管（15mL/50mL）、移液管（1mL/5mL/10mL）、手術器械包（眼科剪、眼科鑷、止血鉗）、無菌紗布、一次性無菌手套、口罩、帽子。
3.3 實驗儀器
（1）細胞培養箱：37℃、5% CO?、飽和濕度；
（2）高速冷凍離心機：轉速可調（0-5000r/min），可制冷（4℃）；
（3）超凈工作臺（生物安全柜）：Class II級，無菌操作環境；
（4）倒置顯微鏡：配備10x、20x、40x物鏡，用于觀察細胞形態和活性；
（5）恒溫水浴鍋：可調節溫度（37℃），用于預熱試劑和酶解消化；
（6）高壓蒸汽滅菌鍋：用于滅菌試劑和耗材；
（7）電子天平：精度0.1mg，用于稱量試劑；
（8）移液器：10ul、100ul、1000ul，配套無菌吸頭；
（9）無菌操作臺、酒精燈、試管架、離心管架等。
4. 實驗準備
4.1 無菌環境準備
實驗前30min，開啟超凈工作臺紫外燈消毒30min，關閉紫外燈后通風10min；用75%乙醇擦拭超凈工作臺臺面、實驗儀器（移液器、離心管架等）及手術器械；實驗人員穿戴無菌手套、口罩、帽子，雙手用75%乙醇消毒，避免雜菌污染。
4.2 試劑與耗材準備
（1）將PBS緩沖液、終止液、完全培養基從4℃冰箱取出，置于37℃恒溫水浴鍋預熱30min；胰蛋白酶-EDTA消化液單獨預熱，避免血清影響消化效果；
（2）檢查無菌耗材包裝是否完好，無破損、無漏氣，按需擺放至超凈工作臺內；
（3）配制臺盼藍染色液，過濾除菌后備用；完全培養基現配現用，配制后輕輕顛倒混勻，避免氣泡產生。
4.3 實驗動物準備
將實驗地鼠用頸椎脫臼法處死，立即放入75%乙醇中浸泡5min，徹底消毒體表（尤其是腹部區域），避免體表細菌污染腎臟組織；將消毒后的地鼠轉移至超凈工作臺內，腹部朝上放置，用無菌紗布固定四肢。
5. 實驗步驟（無菌操作全程）
5.1 腎臟組織分離
（1）用無菌眼科剪沿地鼠腹部中線剪開皮膚和腹膜，逐層分離組織，暴露腹腔內器官；用眼科鑷輕輕撥開腸道、肝臟等器官，找到雙側腎臟（呈暗紅色、橢圓形，位于脊柱兩側）；
（2）用止血鉗夾住腎臟蒂部（連接腎臟與血管、輸尿管的部位），用眼科剪剪斷蒂部，取出雙側腎臟，立即放入盛有預冷無菌PBS緩沖液的培養皿中；
（3）用無菌眼科鑷剔除腎臟表面的脂肪組織、結締組織及殘留的血管、輸尿管，用PBS緩沖液反復沖洗3次，每次沖洗后更換新的PBS，直至腎臟表面無雜質、顏色均勻（暗紅色）。
5.2 腎實質細胞機械分離與酶解消化
（1）將清洗干凈的腎臟放入新的無菌培養皿中，加入1mL預冷PBS緩沖液，用無菌眼科剪將腎臟剪成1mm³左右的細小組織塊（盡量剪碎，避免大塊組織影響酶解效果），剪碎過程中可補充少量PBS，防止組織干燥；
（2）用無菌移液管將組織塊轉移至15mL無菌離心管中，加入5mL預熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕顛倒離心管，使組織塊與消化液充分混合；
（3）將離心管放入37℃恒溫水浴鍋中，酶解消化15-20min，期間每5min輕輕顛倒離心管1次，觀察組織塊變化（組織塊逐漸分散、變渾濁，說明消化有效）；
（4）當組織塊大部分分散成細小顆粒、離心管內液體呈渾濁狀時，立即加入5mL預熱的終止液，輕輕顛倒混勻，終止胰蛋白酶的消化作用（避免過度消化導致細胞破裂、活性下降）；
（5）用無菌移液管反復吹打離心管內的混合物20-30次（吹打力度適中，避免產生大量氣泡損傷細胞），使組織塊進一步分散，釋放單個細胞；吹打后靜置2min，讓未消化完全的組織塊沉淀，吸取上清液（含單個細胞）至另一支15mL無菌離心管中；
（6）向剩余未消化完全的組織塊中，再加入3mL預熱的胰蛋白酶-EDTA消化液，再次消化、終止、吹打、收集上清液，合并兩次收集的上清液（最大限度獲取單個細胞）。
5.3 細胞純化與離心洗滌
（1）將合并后的細胞懸液放入高速冷凍離心機中，4℃、1000r/min離心5min，棄上清液（含胰蛋白酶、終止液及破碎細胞），沉淀為腎實質細胞；
（2）向離心管中加入5mL預冷的無菌PBS緩沖液，用無菌移液管輕輕吹打沉淀，使細胞重新懸浮，制成細胞懸液；4℃、1000r/min離心5min，棄上清液，重復洗滌2次（去除殘留的酶液、血清及雜質，提高細胞純度）；
（3）末次離心后，棄上清液，向離心管中加入2mL完全培養基，輕輕吹打沉淀，使細胞均勻懸浮，制成單細胞懸液。
5.4 細胞活力檢測與接種
（1）細胞活力檢測：取10ul細胞懸液與10ul臺盼藍染色液混合均勻，靜置3min后，滴加至血細胞計數板上，置于倒置顯微鏡下觀察計數；活細胞呈無色透明，死細胞被臺盼藍染成藍色，計算細胞活力（活細胞數/總細胞數×100%），活力≥90%方可用于接種；同時計數細胞濃度，調整細胞濃度至1×10?-5×10?個/mL；
（2）細胞接種：將無菌培養皿（60mm）置于超凈工作臺內，每皿加入6mL調整好濃度的細胞懸液，輕輕晃動培養皿，使細胞均勻分布在培養皿底部（避免細胞聚集）；
（3）接種完成后，在培養皿蓋邊緣做好標記（注明細胞名稱、接種日期、實驗人員），將培養皿放入37℃、5% CO?、飽和濕度的細胞培養箱中，靜置培養。
5.5 原代細胞培養與換液
（1）接種后24h內，避免移動培養皿，讓細胞充分貼壁（腎實質細胞貼壁較慢，24h后可在倒置顯微鏡下觀察到少量貼壁細胞，呈梭形或多邊形）；
（2）首次換液：接種后48h，取出培養皿，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁情況，輕輕吸棄上清液（避免吸到貼壁細胞），加入2mL新鮮的完全培養基，輕輕晃動培養皿，沖洗貼壁細胞表面的殘留雜質，再吸棄培養基，重新加入6mL新鮮完全培養基，放入培養箱繼續培養；
（3）常規換液：之后每2-3天換液1次，換液操作同首次換液，換液時觀察細胞形態、密度及有無污染（若培養基變渾濁、出現白色絮狀物，說明存在細菌污染；若出現圓形、漂浮的異常細胞，說明可能存在真菌污染，需及時處理）；
（4）細胞傳代：當細胞密度達到80%-90%匯合時（倒置顯微鏡下觀察，細胞鋪滿培養皿底部，相互接觸但未重疊），進行傳代培養（原代細胞傳代次數不宜過多，一般傳3-5代，避免細胞老化、特性改變）。
5.6 細胞傳代步驟
（1）吸棄培養皿中的舊培養基，用PBS緩沖液輕輕沖洗貼壁細胞2次，吸棄PBS；
（2）加入1mL預熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕晃動培養皿，使消化液均勻覆蓋細胞表面，放入37℃培養箱中消化3-5min，期間在倒置顯微鏡下觀察，當細胞變圓、間隙增大、開始脫落時，立即加入1mL終止液，終止消化；
（3）用無菌移液管輕輕吹打培養皿底部，使貼壁細胞完全脫落，制成細胞懸液，轉移至15mL離心管中；
（4）4℃、1000r/min離心5min，棄上清液，加入2mL完全培養基，吹打均勻，調整細胞濃度至1×10?個/mL左右；
（5）將細胞懸液接種至新的無菌培養皿中，每皿加入6mL，標記后放入培養箱繼續培養，傳代比例建議1:2-1:3。
48小時形態觀察
72小時形態觀察
96小時形態觀察
6. 注意事項
（1）無菌操作是實驗成功的關鍵，全程在超凈工作臺內進行，實驗器械、耗材、試劑需嚴格滅菌，實驗人員需做好無菌防護，避免雜菌污染；
（2）酶解消化是核心步驟，需嚴格控制消化時間和溫度，避免過度消化（導致細胞活性下降、破裂）或消化不充分（細胞分散不佳、產量低）；消化過程中需密切觀察組織塊變化，及時終止消化；
（3）細胞吹打時力度要適中，避免用力過猛產生大量氣泡，氣泡會損傷細胞；吹打要充分，確保細胞分散成單個細胞懸液，避免細胞聚集影響貼壁和生長；
（4）所有試劑需提前預熱至37℃（除PBS可預冷外），避免溫度驟變損傷細胞；離心時溫度控制在4℃，轉速和時間準確，避免離心過快導致細胞破裂；
（5）培養過程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態、貼壁情況、密度及有無污染，發現異常及時處理（如污染細胞需立即丟棄，避免交叉污染）；
（6）胎牛血清、EGF、ITS等添加試劑需妥善保存（-20℃或-80℃），避免反復凍融，影響其活性；完全培養基現配現用，配制后4℃保存不超過1周；
（7）實驗動物處死需符合倫理要求，操作輕柔，避免過度損傷腎臟組織；腎臟組織取出后需盡快處理，避免放置時間過長導致細胞活力下降；
（8）臺盼藍染色后需在5min內完成細胞計數，避免染色時間過長導致活細胞被染色，影響計數結果。
7. 質量控制標準
（1）細胞活力：原代分離后細胞活力≥90%，傳代后細胞活力≥85%；
（2）細胞純度：倒置顯微鏡下觀察，腎實質細胞（梭形、多邊形，貼壁生長）占比≥90%，雜細胞（如成纖維細胞、紅細胞）占比≤10%；可通過免疫細胞化學染色（如腎小管上皮細胞標志物CK18、腎小球系膜細胞標志物α-SMA）進一步驗證純度；
（3）細胞形態：貼壁后的腎實質細胞形態規則，呈梭形或多邊形，胞質均勻，細胞核清晰，無異常形態（如細胞腫脹、破裂、空泡化）；
（4）培養穩定性：原代細胞可穩定貼壁生長，換液后細胞形態無明顯異常，傳代后3-5天可達到80%-90%匯合，傳3-5代后仍維持原代細胞特性；
（5）無菌要求：培養過程中無細菌、真菌、支原體等污染，培養基清澈透明，無渾濁、無白色絮狀物，細胞無異常漂浮。
8. 實驗廢棄物處理
（1）實驗動物尸體：放入專用生物廢棄物收集袋中，進行高壓蒸汽滅菌后，按生物安全廢棄物處理規定統一丟棄；
（2）細胞懸液、培養基、消化液等液體廢棄物：加入含消毒劑（如84消毒液）的收集容器中，浸泡30min后，倒入專用廢液處理管道；
（3）無菌耗材（離心管、移液管、培養皿等）：使用后放入專用生物廢棄物收集袋中，高壓蒸汽滅菌后，按醫療廢棄物處理；
（4）實驗器械：使用后用75%乙醇擦拭消毒，再進行高壓蒸汽滅菌，晾干后妥善保存，備用。
9. 實驗備注
（1）本Protocol適用于1-2周齡SPF級地鼠，若使用成年地鼠，需適當延長酶解時間（20-25min），且細胞活力和增殖能力可能下降；
（2）胰蛋白酶-EDTA消化液的消化效果受濃度、溫度影響較大，若消化效果不佳，可適當提高胰蛋白酶濃度（不超過0.3%）或延長消化時間（不超過25min）；
（3）若需獲得單一類型的腎實質細胞（如僅腎小管上皮細胞），可在細胞貼壁后48h，利用差速貼壁法（成纖維細胞貼壁速度快于腎小管上皮細胞）去除成纖維細胞，或使用免疫磁珠分選法進一步純化；
（4）細胞培養過程中，可根據細胞生長情況調整換液時間（如細胞密度增長較慢，可延長至3-4天換液1次；若細胞密度增長較快，可縮短至2天換液1次）；
（5）實驗過程中需做好實驗記錄，包括動物信息、接種細胞數、細胞活力、換液時間、傳代次數、細胞生長情況等，便于后續實驗追溯和重復。
原代細胞的提取與培養，既是一門技術，也是一門藝術。從無菌操作的嚴謹，到酶解時間的把控，再到細胞生長的觀察，每一步都考驗著實驗者的耐心與細致。希望這份Protocol能為你提供清晰的操作指引，幫助你在科研道路上少走彎路，收獲更多高質量的實驗數據。
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