忙活大半天，地鼠處死了，腎臟取出來(lái)了，剪刀剪了半天，消化也做了——結(jié)果呢？細(xì)胞沒(méi)貼壁，或者貼壁的全是成纖維細(xì)胞，再或者一夜之間培養(yǎng)皿里漂著一層白毛。
原代腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞提取，翻車的方式遠(yuǎn)比成功的方式多。
酶解時(shí)間差兩分鐘，細(xì)胞活性掉一半；離心轉(zhuǎn)速?zèng)]算對(duì)，想要的細(xì)胞全丟了；培養(yǎng)基少加一樣因子，目的細(xì)胞根本不長(zhǎng)。更別提雜細(xì)胞污染這個(gè)老大難——成纖維細(xì)胞貼著貼著就把腎小管上皮細(xì)胞擠沒(méi)了。
這份原代地鼠腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞分離提取及培養(yǎng)Protocol，正是針對(duì)這些高頻翻車點(diǎn)來(lái)的。從組織離體到細(xì)胞貼壁，把消化時(shí)間、離心參數(shù)、培養(yǎng)基配方、雜細(xì)胞控制這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的參數(shù)和操作邏輯全部拆解清楚。照著做，至少能幫你避開(kāi)80%的坑。
1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
高效分離、提取健康地鼠的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞（主要為腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等），建立穩(wěn)定的原代培養(yǎng)體系，獲得高活性、高純度的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞，為后續(xù)細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)、血清篩選等研究提供合格的細(xì)胞材料。
2. 實(shí)驗(yàn)原理
利用機(jī)械分離結(jié)合酶解消化法，打破地鼠腎臟組織的細(xì)胞間連接（如膠原纖維、細(xì)胞黏附分子等），釋放單個(gè)腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞；通過(guò)差速離心去除雜質(zhì)、紅細(xì)胞及破碎細(xì)胞，保留活性完整的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞；在適宜的培養(yǎng)條件（特定培養(yǎng)基、溫度、氣體環(huán)境）下，模擬體內(nèi)生理環(huán)境，使腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)、增殖，維持其原代細(xì)胞特性。
關(guān)鍵要點(diǎn)：嚴(yán)格控制酶解時(shí)間和溫度，避免過(guò)度消化損傷細(xì)胞活性；選擇適配腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)基，添加必要的生長(zhǎng)因子和血清，抑制成纖維細(xì)胞等雜細(xì)胞過(guò)度生長(zhǎng)，提高細(xì)胞純度。
3. 實(shí)驗(yàn)材料與儀器
3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
健康SPF級(jí)地鼠，1-2周齡（幼鼠腎組織活力高、細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，雜細(xì)胞污染少），雌雄不限，體重5-10g；實(shí)驗(yàn)前禁食12h，自由飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1-2d。
3.2 試劑耗材（無(wú)菌級(jí)）
（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基（1:1），不含血清和抗生素；
（2）消化液：0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（胰蛋白酶終濃度0.25%，EDTA終濃度0.02%），提前37℃預(yù)熱；
（3）終止液：含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基，提前37℃預(yù)熱；
（4）清洗液：PBS緩沖液（pH7.2-7.4），添加青霉素（100U/mL）、鏈霉素（100μg/mL），高壓蒸汽滅菌后4℃保存；
（5）完全培養(yǎng)基：DMEM/F12培養(yǎng)基（1:1）+ 10% FBS + 1%雙抗（青霉素100U/mL+鏈霉素100ug/mL）+ 0.1%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒（ITS）+ 10ng/mL表皮生長(zhǎng)因子（EGF），過(guò)濾除菌后4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用；
（6）其他試劑：75%乙醇（無(wú)菌）、0.22μm濾器、臺(tái)盼藍(lán)染色液（0.4%）；
（7）無(wú)菌耗材：培養(yǎng)皿（60mm/100mm）、離心管（15mL/50mL）、移液管（1mL/5mL/10mL）、手術(shù)器械包（眼科剪、眼科鑷、止血鉗）、無(wú)菌紗布、一次性無(wú)菌手套、口罩、帽子。
3.3 實(shí)驗(yàn)儀器
（1）細(xì)胞培養(yǎng)箱：37℃、5% CO?、飽和濕度；
（2）高速冷凍離心機(jī)：轉(zhuǎn)速可調(diào)（0-5000r/min），可制冷（4℃）；
（3）超凈工作臺(tái)（生物安全柜）：Class II級(jí)，無(wú)菌操作環(huán)境；
（4）倒置顯微鏡：配備10x、20x、40x物鏡，用于觀察細(xì)胞形態(tài)和活性；
（5）恒溫水浴鍋：可調(diào)節(jié)溫度（37℃），用于預(yù)熱試劑和酶解消化；
（6）高壓蒸汽滅菌鍋：用于滅菌試劑和耗材；
（7）電子天平：精度0.1mg，用于稱量試劑；
（8）移液器：10ul、100ul、1000ul，配套無(wú)菌吸頭；
（9）無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、試管架、離心管架等。
4. 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
4.1 無(wú)菌環(huán)境準(zhǔn)備
實(shí)驗(yàn)前30min，開(kāi)啟超凈工作臺(tái)紫外燈消毒30min，關(guān)閉紫外燈后通風(fēng)10min；用75%乙醇擦拭超凈工作臺(tái)臺(tái)面、實(shí)驗(yàn)儀器（移液器、離心管架等）及手術(shù)器械；實(shí)驗(yàn)人員穿戴無(wú)菌手套、口罩、帽子，雙手用75%乙醇消毒，避免雜菌污染。
4.2 試劑與耗材準(zhǔn)備
（1）將PBS緩沖液、終止液、完全培養(yǎng)基從4℃冰箱取出，置于37℃恒溫水浴鍋預(yù)熱30min；胰蛋白酶-EDTA消化液?jiǎn)为?dú)預(yù)熱，避免血清影響消化效果；
（2）檢查無(wú)菌耗材包裝是否完好，無(wú)破損、無(wú)漏氣，按需擺放至超凈工作臺(tái)內(nèi)；
（3）配制臺(tái)盼藍(lán)染色液，過(guò)濾除菌后備用；完全培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后輕輕顛倒混勻，避免氣泡產(chǎn)生。
4.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)備
將實(shí)驗(yàn)地鼠用頸椎脫臼法處死，立即放入75%乙醇中浸泡5min，徹底消毒體表（尤其是腹部區(qū)域），避免體表細(xì)菌污染腎臟組織；將消毒后的地鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)內(nèi)，腹部朝上放置，用無(wú)菌紗布固定四肢。
5. 實(shí)驗(yàn)步驟（無(wú)菌操作全程）
5.1 腎臟組織分離
（1）用無(wú)菌眼科剪沿地鼠腹部中線剪開(kāi)皮膚和腹膜，逐層分離組織，暴露腹腔內(nèi)器官；用眼科鑷輕輕撥開(kāi)腸道、肝臟等器官，找到雙側(cè)腎臟（呈暗紅色、橢圓形，位于脊柱兩側(cè)）；
（2）用止血鉗夾住腎臟蒂部（連接腎臟與血管、輸尿管的部位），用眼科剪剪斷蒂部，取出雙側(cè)腎臟，立即放入盛有預(yù)冷無(wú)菌PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中；
（3）用無(wú)菌眼科鑷剔除腎臟表面的脂肪組織、結(jié)締組織及殘留的血管、輸尿管，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次，每次沖洗后更換新的PBS，直至腎臟表面無(wú)雜質(zhì)、顏色均勻（暗紅色）。
5.2 腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞機(jī)械分離與酶解消化
（1）將清洗干凈的腎臟放入新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，加入1mL預(yù)冷PBS緩沖液，用無(wú)菌眼科剪將腎臟剪成1mm³左右的細(xì)小組織塊（盡量剪碎，避免大塊組織影響酶解效果），剪碎過(guò)程中可補(bǔ)充少量PBS，防止組織干燥；
（2）用無(wú)菌移液管將組織塊轉(zhuǎn)移至15mL無(wú)菌離心管中，加入5mL預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕顛倒離心管，使組織塊與消化液充分混合；
（3）將離心管放入37℃恒溫水浴鍋中，酶解消化15-20min，期間每5min輕輕顛倒離心管1次，觀察組織塊變化（組織塊逐漸分散、變渾濁，說(shuō)明消化有效）；
（4）當(dāng)組織塊大部分分散成細(xì)小顆粒、離心管內(nèi)液體呈渾濁狀時(shí)，立即加入5mL預(yù)熱的終止液，輕輕顛倒混勻，終止胰蛋白酶的消化作用（避免過(guò)度消化導(dǎo)致細(xì)胞破裂、活性下降）；
（5）用無(wú)菌移液管反復(fù)吹打離心管內(nèi)的混合物20-30次（吹打力度適中，避免產(chǎn)生大量氣泡損傷細(xì)胞），使組織塊進(jìn)一步分散，釋放單個(gè)細(xì)胞；吹打后靜置2min，讓未消化完全的組織塊沉淀，吸取上清液（含單個(gè)細(xì)胞）至另一支15mL無(wú)菌離心管中；
（6）向剩余未消化完全的組織塊中，再加入3mL預(yù)熱的胰蛋白酶-EDTA消化液，再次消化、終止、吹打、收集上清液，合并兩次收集的上清液（最大限度獲取單個(gè)細(xì)胞）。
5.3 細(xì)胞純化與離心洗滌
（1）將合并后的細(xì)胞懸液放入高速冷凍離心機(jī)中，4℃、1000r/min離心5min，棄上清液（含胰蛋白酶、終止液及破碎細(xì)胞），沉淀為腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞；
（2）向離心管中加入5mL預(yù)冷的無(wú)菌PBS緩沖液，用無(wú)菌移液管輕輕吹打沉淀，使細(xì)胞重新懸浮，制成細(xì)胞懸液；4℃、1000r/min離心5min，棄上清液，重復(fù)洗滌2次（去除殘留的酶液、血清及雜質(zhì)，提高細(xì)胞純度）；
（3）末次離心后，棄上清液，向離心管中加入2mL完全培養(yǎng)基，輕輕吹打沉淀，使細(xì)胞均勻懸浮，制成單細(xì)胞懸液。
5.4 細(xì)胞活力檢測(cè)與接種
（1）細(xì)胞活力檢測(cè)：取10ul細(xì)胞懸液與10ul臺(tái)盼藍(lán)染色液混合均勻，靜置3min后，滴加至血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于倒置顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)；活細(xì)胞呈無(wú)色透明，死細(xì)胞被臺(tái)盼藍(lán)染成藍(lán)色，計(jì)算細(xì)胞活力（活細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%），活力≥90%方可用于接種；同時(shí)計(jì)數(shù)細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?-5×10?個(gè)/mL；
（2）細(xì)胞接種：將無(wú)菌培養(yǎng)皿（60mm）置于超凈工作臺(tái)內(nèi)，每皿加入6mL調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使細(xì)胞均勻分布在培養(yǎng)皿底部（避免細(xì)胞聚集）；
（3）接種完成后，在培養(yǎng)皿蓋邊緣做好標(biāo)記（注明細(xì)胞名稱、接種日期、實(shí)驗(yàn)人員），將培養(yǎng)皿放入37℃、5% CO?、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)。
5.5 原代細(xì)胞培養(yǎng)與換液
（1）接種后24h內(nèi)，避免移動(dòng)培養(yǎng)皿，讓細(xì)胞充分貼壁（腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞貼壁較慢，24h后可在倒置顯微鏡下觀察到少量貼壁細(xì)胞，呈梭形或多邊形）；
（2）首次換液：接種后48h，取出培養(yǎng)皿，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況，輕輕吸棄上清液（避免吸到貼壁細(xì)胞），加入2mL新鮮的完全培養(yǎng)基，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，沖洗貼壁細(xì)胞表面的殘留雜質(zhì)，再吸棄培養(yǎng)基，重新加入6mL新鮮完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)；
（3）常規(guī)換液：之后每2-3天換液1次，換液操作同首次換液，換液時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)、密度及有無(wú)污染（若培養(yǎng)基變渾濁、出現(xiàn)白色絮狀物，說(shuō)明存在細(xì)菌污染；若出現(xiàn)圓形、漂浮的異常細(xì)胞，說(shuō)明可能存在真菌污染，需及時(shí)處理）；
（4）細(xì)胞傳代：當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%匯合時(shí)（倒置顯微鏡下觀察，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底部，相互接觸但未重疊），進(jìn)行傳代培養(yǎng)（原代細(xì)胞傳代次數(shù)不宜過(guò)多，一般傳3-5代，避免細(xì)胞老化、特性改變）。
5.6 細(xì)胞傳代步驟
（1）吸棄培養(yǎng)皿中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗貼壁細(xì)胞2次，吸棄PBS；
（2）加入1mL預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿，使消化液均勻覆蓋細(xì)胞表面，放入37℃培養(yǎng)箱中消化3-5min，期間在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、間隙增大、開(kāi)始脫落時(shí)，立即加入1mL終止液，終止消化；
（3）用無(wú)菌移液管輕輕吹打培養(yǎng)皿底部，使貼壁細(xì)胞完全脫落，制成細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中；
（4）4℃、1000r/min離心5min，棄上清液，加入2mL完全培養(yǎng)基，吹打均勻，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×10?個(gè)/mL左右；
（5）將細(xì)胞懸液接種至新的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿加入6mL，標(biāo)記后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，傳代比例建議1:2-1:3。
48小時(shí)形態(tài)觀察
72小時(shí)形態(tài)觀察
96小時(shí)形態(tài)觀察
6. 注意事項(xiàng)
（1）無(wú)菌操作是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵，全程在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)器械、耗材、試劑需嚴(yán)格滅菌，實(shí)驗(yàn)人員需做好無(wú)菌防護(hù)，避免雜菌污染；
（2）酶解消化是核心步驟，需嚴(yán)格控制消化時(shí)間和溫度，避免過(guò)度消化（導(dǎo)致細(xì)胞活性下降、破裂）或消化不充分（細(xì)胞分散不佳、產(chǎn)量低）；消化過(guò)程中需密切觀察組織塊變化，及時(shí)終止消化；
（3）細(xì)胞吹打時(shí)力度要適中，避免用力過(guò)猛產(chǎn)生大量氣泡，氣泡會(huì)損傷細(xì)胞；吹打要充分，確保細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，避免細(xì)胞聚集影響貼壁和生長(zhǎng)；
（4）所有試劑需提前預(yù)熱至37℃（除PBS可預(yù)冷外），避免溫度驟變損傷細(xì)胞；離心時(shí)溫度控制在4℃，轉(zhuǎn)速和時(shí)間準(zhǔn)確，避免離心過(guò)快導(dǎo)致細(xì)胞破裂；
（5）培養(yǎng)過(guò)程中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁情況、密度及有無(wú)污染，發(fā)現(xiàn)異常及時(shí)處理（如污染細(xì)胞需立即丟棄，避免交叉污染）；
（6）胎牛血清、EGF、ITS等添加試劑需妥善保存（-20℃或-80℃），避免反復(fù)凍融，影響其活性；完全培養(yǎng)基現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后4℃保存不超過(guò)1周；
（7）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死需符合倫理要求，操作輕柔，避免過(guò)度損傷腎臟組織；腎臟組織取出后需盡快處理，避免放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞活力下降；
（8）臺(tái)盼藍(lán)染色后需在5min內(nèi)完成細(xì)胞計(jì)數(shù)，避免染色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致活細(xì)胞被染色，影響計(jì)數(shù)結(jié)果。
7. 質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)
（1）細(xì)胞活力：原代分離后細(xì)胞活力≥90%，傳代后細(xì)胞活力≥85%；
（2）細(xì)胞純度：倒置顯微鏡下觀察，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞（梭形、多邊形，貼壁生長(zhǎng)）占比≥90%，雜細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、紅細(xì)胞）占比≤10%；可通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)染色（如腎小管上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK18、腎小球系膜細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA）進(jìn)一步驗(yàn)證純度；
（3）細(xì)胞形態(tài)：貼壁后的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，呈梭形或多邊形，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核清晰，無(wú)異常形態(tài)（如細(xì)胞腫脹、破裂、空泡化）；
（4）培養(yǎng)穩(wěn)定性：原代細(xì)胞可穩(wěn)定貼壁生長(zhǎng)，換液后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常，傳代后3-5天可達(dá)到80%-90%匯合，傳3-5代后仍維持原代細(xì)胞特性；
（5）無(wú)菌要求：培養(yǎng)過(guò)程中無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體等污染，培養(yǎng)基清澈透明，無(wú)渾濁、無(wú)白色絮狀物，細(xì)胞無(wú)異常漂浮。
8. 實(shí)驗(yàn)廢棄物處理
（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尸體：放入專用生物廢棄物收集袋中，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后，按生物安全廢棄物處理規(guī)定統(tǒng)一丟棄；
（2）細(xì)胞懸液、培養(yǎng)基、消化液等液體廢棄物：加入含消毒劑（如84消毒液）的收集容器中，浸泡30min后，倒入專用廢液處理管道；
（3）無(wú)菌耗材（離心管、移液管、培養(yǎng)皿等）：使用后放入專用生物廢棄物收集袋中，高壓蒸汽滅菌后，按醫(yī)療廢棄物處理；
（4）實(shí)驗(yàn)器械：使用后用75%乙醇擦拭消毒，再進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，晾干后妥善保存，備用。
9. 實(shí)驗(yàn)備注
（1）本Protocol適用于1-2周齡SPF級(jí)地鼠，若使用成年地鼠，需適當(dāng)延長(zhǎng)酶解時(shí)間（20-25min），且細(xì)胞活力和增殖能力可能下降；
（2）胰蛋白酶-EDTA消化液的消化效果受濃度、溫度影響較大，若消化效果不佳，可適當(dāng)提高胰蛋白酶濃度（不超過(guò)0.3%）或延長(zhǎng)消化時(shí)間（不超過(guò)25min）；
（3）若需獲得單一類型的腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞（如僅腎小管上皮細(xì)胞），可在細(xì)胞貼壁后48h，利用差速貼壁法（成纖維細(xì)胞貼壁速度快于腎小管上皮細(xì)胞）去除成纖維細(xì)胞，或使用免疫磁珠分選法進(jìn)一步純化；
（4）細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況調(diào)整換液時(shí)間（如細(xì)胞密度增長(zhǎng)較慢，可延長(zhǎng)至3-4天換液1次；若細(xì)胞密度增長(zhǎng)較快，可縮短至2天換液1次）；
（5）實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需做好實(shí)驗(yàn)記錄，包括動(dòng)物信息、接種細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力、換液時(shí)間、傳代次數(shù)、細(xì)胞生長(zhǎng)情況等，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)追溯和重復(fù)。
原代細(xì)胞的提取與培養(yǎng)，既是一門(mén)技術(shù)，也是一門(mén)藝術(shù)。從無(wú)菌操作的嚴(yán)謹(jǐn)，到酶解時(shí)間的把控，再到細(xì)胞生長(zhǎng)的觀察，每一步都考驗(yàn)著實(shí)驗(yàn)者的耐心與細(xì)致。希望這份Protocol能為你提供清晰的操作指引，幫助你在科研道路上少走彎路，收獲更多高質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
你在原代腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞提取中踩過(guò)哪些坑？消化時(shí)間把控、雜細(xì)胞去除、污染防控……歡迎在評(píng)論區(qū)分享你的經(jīng)驗(yàn)或疑問(wèn)。我們將從留言中選出3位，贈(zèng)送金源康定制禮品一份