再灌注治療是應對急性心肌梗死的重要方式，可有效幫助缺血組織恢復供血供氧。然而缺血組織恢復血流后可能發生再灌注損傷，導致心肌損傷程度進一步加劇。目前，再灌注損傷的發生機制仍不完全清楚。先前已有研究使用單細胞測序技術對再灌注損傷所涉及的細胞類型復雜的異質性進行探究，但該技術不能保存細胞在組織內的空間信息；另一方面，常規轉錄組分析無法在單細胞層面上研究蛋白質翻譯后修飾。除此之外，如何防止再灌注損傷的發生也是研究中的重要課題。
為了解決這些難題，中國醫學科學院阜外醫院心血管疾病國家重點實驗室的王利教授團隊利用Standard BioTools公司的組織成像質譜流式（Imaging mass cytometry, IMC）技術對小鼠再灌注損傷模型的心臟單細胞蛋白修飾時空圖譜進行了描繪。該研究名為“Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury”，已于2023年5月30日發表于《Circulation Research》（IF = 23.213）。
圖1. 研究示意圖
組織成像質譜流式技術利用金屬標簽抗體代替傳統的熒光抗體對切片進行染色，以飛行時間質譜的檢測方式區分不同的金屬同位素標簽，可在單張切片上同時檢測數十種靶標。該技術無需循環染色并徹底解決熒光基團間嚴重的串色問題，兼具通道多、背景低、數據質量高等特點。通過分析，研究者可在單細胞層面獲得數十種蛋白表達水平及細胞定位，從而深入挖掘細胞表型和功能及分析細胞間位置關系。這項研究使用的panel包含29個抗體，其靶標除了細胞分型標志物外，還涵蓋了與再灌注損傷相關的激酶通路和甲基化、乙?；冉M蛋白修飾的靶標。
研究使用了小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，在缺血前和再灌注后共8個時間點采集樣品，將小鼠心臟分為基底部（basal）、中部（mid-cavity）、心尖部（apical）和心尖（apex），將每個部分的前壁（anterior）、側壁（lateral）和下壁（inferior）分別進行研究，共12個部分。在對所有時間點和所有分區的組織切片進行染色和采集數據后，研究團隊共獲得了251組圖片，通過分析得到了197063個單細胞數據。
圖2. 研究panel (A) 及流程(B)
通過分型標志物，心臟細胞可被定義為心肌細胞（CM）、內皮細胞（EC）、成纖維細胞（FB）、巨噬細胞（MP）和平滑肌細胞（SMC）等類型。在再灌注損傷三天后，部分區域出現心肌細胞顯著損失；同時，相同區域內纖維化程度明顯增加。血管生成則分為兩個階段：數小時內的快速生成多發生在基底部和中部，而至少12小時后的中長期響應則發生在心尖部。這些現象說明該模型與已知病理反應相符，也證明了IMC捕捉動物模型心室壁細胞變化的能力。
圖3. 不同細胞類型的時空變化；(C) 根據表達量區分單細胞的UMAP圖；(D)熱圖顯示心肌細胞細胞在各時間點各區域的量；(E)熱圖顯示內皮細胞在各時間點各區域的量；(F)IMC圖片顯示不同時間點的心肌細胞和纖維化標志物；(G) 各時間點各區域纖維化打分
接下來，研究團隊進行了細胞社群分析，利用細胞間空間位置數據將細胞分成23類不同的群落（community clusters, CCs）。其中大多數群落中的主要細胞類型為心肌細胞，有三類群落中最多的是成纖維細胞，另有三類相對富集內皮細胞和三類相對富集平滑肌細胞的群落。分析發現細胞群落與局部組織結構有明顯關聯，集中體現在不同群落距離不同類型血管的遠近上。研究團隊進一步比較了健康心臟與再灌注損傷后細胞群落的變化，發現損傷后細胞群落快速改變，而梗死區域、邊緣區域和遙遠區域的變化趨勢并不相同。這不僅揭示了再灌注損傷后病理反應的異質性，也再次說明了研究不同解剖位置的重要性。
圖4. 細胞群落鑒定；(A)群落分析示意圖；(B)23類群落的tSNE圖；(C)不同群落的細胞組成；(D)代表性的IMC及對應群落圖像
圖5. 再灌注損傷后細胞群落快速變化；(A)不同區域各群落隨時間的變化；(B)聚類分析顯示每個時間點對應一種群落模式，說明群落隨時間快速變化；(C)再灌注損傷后梗死、邊緣和遙遠區域顯著改變的群落
為了揭示再灌注損傷后關鍵的信號轉導與表觀遺傳學變化，研究人員利用IMC的多靶標panel分析了7種磷酸化蛋白和14種組蛋白翻譯后修飾事件。信號通路激活也表現出區域特異性，以梗死的邊緣區域最為明顯。時間軸上，RAS-ERK通路被迅速激活，而其他通路在至少一天后才有明顯激活，說明它們在損傷修復等過程中可能有作用。與此相對的是，信號通路激活的區域通常對應著較少的組蛋白修飾。
研究者接下來使用無監督聚類分析產生了13類翻譯后修飾簇（posttranslational modification intensity (PTMI) subgroups），用以進一步確立與時空關聯的細胞特異性翻譯后修飾特征。其中，再灌注損傷中期的翻譯后修飾簇中富集內皮細胞的細胞群落含量明顯增加，說明內皮細胞的信號通路與表觀遺傳學改變對再灌注損傷進展至關重要。而晚期變化則與成纖維細胞主導的細胞群落相關。
圖6. 信號通路與表觀遺傳調節；(A)各區域各時間點的翻譯后修飾信號強度；(B)IMC圖片顯示翻譯后修飾信號改變；(C) 13類翻譯后修飾簇的UMAP顯示；(D)聚類分析將翻譯后修飾信號分為三大類（PTMI_KC），分別對應不同時間區段
通過深入分析再灌注損傷中期的翻譯后修飾變化，研究人員發現梗死和邊緣區域的內皮細胞中H3K9me3明顯升高。為了驗證H3K9me3的作用，他們使用了經體外編輯后降低了H3K9甲基化的內皮細胞。注射有這種內皮細胞的小鼠心臟在再灌注損傷后射血分數和縮短分數明顯改善，血管生成增多，而纖維化明顯降低。其他實驗進一步證明了H3K9me3直接調節內皮細胞功能基因的表達。因此，H3K9me3有望成為再灌注損傷干預的新靶點。
圖7. 降低內皮細胞H3K9me3改善再灌注損傷結果；(A)三大類翻譯后修飾信號群中細胞類型（左）和PTMI_KC3中細胞群落組成（右）；(B)內皮細胞各PTMI中翻譯后修飾信號強度；(C)注射編輯后內皮細胞的實驗流程；(D)體外編輯降低H3K9me3強度；(E)降低內皮細胞H3K9me3后射血分數和縮短分數明顯改善
這篇文章是IMC在心血管疾病領域的極佳應用案例。研究團隊利用IMC通道多、背景低等特點，對心肌梗死再灌注損傷后各解剖區域和時間點進行了全面的單細胞分析，并克服了單細胞測序等手段的不足，探究了疾病相關的細胞群落、信號通路和表觀遺傳學變化，并最終發現了細胞特異的新潛在治療靶點。在此，我們對中國醫學科學院阜外醫院的研究團隊表示衷心的祝賀！?
參考文獻：
Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Circ Res. 2023 Jun 23;133(1):86-103. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.322620.