再灌注治療是應(yīng)對(duì)急性心肌梗死的重要方式，可有效幫助缺血組織恢復(fù)供血供氧。然而缺血組織恢復(fù)血流后可能發(fā)生再灌注損傷，導(dǎo)致心肌損傷程度進(jìn)一步加劇。目前，再灌注損傷的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。先前已有研究使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)再灌注損傷所涉及的細(xì)胞類型復(fù)雜的異質(zhì)性進(jìn)行探究，但該技術(shù)不能保存細(xì)胞在組織內(nèi)的空間信息；另一方面，常規(guī)轉(zhuǎn)錄組分析無(wú)法在單細(xì)胞層面上研究蛋白質(zhì)翻譯后修飾。除此之外，如何防止再灌注損傷的發(fā)生也是研究中的重要課題。
為了解決這些難題，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院心血管疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的王利教授團(tuán)隊(duì)利用Standard BioTools公司的組織成像質(zhì)譜流式（Imaging mass cytometry, IMC）技術(shù)對(duì)小鼠再灌注損傷模型的心臟單細(xì)胞蛋白修飾時(shí)空?qǐng)D譜進(jìn)行了描繪。該研究名為“Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury”，已于2023年5月30日發(fā)表于《Circulation Research》（IF = 23.213）。
圖1. 研究示意圖
組織成像質(zhì)譜流式技術(shù)利用金屬標(biāo)簽抗體代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熒光抗體對(duì)切片進(jìn)行染色，以飛行時(shí)間質(zhì)譜的檢測(cè)方式區(qū)分不同的金屬同位素標(biāo)簽，可在單張切片上同時(shí)檢測(cè)數(shù)十種靶標(biāo)。該技術(shù)無(wú)需循環(huán)染色并徹底解決熒光基團(tuán)間嚴(yán)重的串色問題，兼具通道多、背景低、數(shù)據(jù)質(zhì)量高等特點(diǎn)。通過分析，研究者可在單細(xì)胞層面獲得數(shù)十種蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞定位，從而深入挖掘細(xì)胞表型和功能及分析細(xì)胞間位置關(guān)系。這項(xiàng)研究使用的panel包含29個(gè)抗體，其靶標(biāo)除了細(xì)胞分型標(biāo)志物外，還涵蓋了與再灌注損傷相關(guān)的激酶通路和甲基化、乙酰化等組蛋白修飾的靶標(biāo)。
研究使用了小鼠心肌缺血再灌注損傷模型，在缺血前和再灌注后共8個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集樣品，將小鼠心臟分為基底部（basal）、中部（mid-cavity）、心尖部（apical）和心尖（apex），將每個(gè)部分的前壁（anterior）、側(cè)壁（lateral）和下壁（inferior）分別進(jìn)行研究，共12個(gè)部分。在對(duì)所有時(shí)間點(diǎn)和所有分區(qū)的組織切片進(jìn)行染色和采集數(shù)據(jù)后，研究團(tuán)隊(duì)共獲得了251組圖片，通過分析得到了197063個(gè)單細(xì)胞數(shù)據(jù)。
圖2. 研究panel (A) 及流程(B)
通過分型標(biāo)志物，心臟細(xì)胞可被定義為心肌細(xì)胞（CM）、內(nèi)皮細(xì)胞（EC）、成纖維細(xì)胞（FB）、巨噬細(xì)胞（MP）和平滑肌細(xì)胞（SMC）等類型。在再灌注損傷三天后，部分區(qū)域出現(xiàn)心肌細(xì)胞顯著損失；同時(shí)，相同區(qū)域內(nèi)纖維化程度明顯增加。血管生成則分為兩個(gè)階段：數(shù)小時(shí)內(nèi)的快速生成多發(fā)生在基底部和中部，而至少12小時(shí)后的中長(zhǎng)期響應(yīng)則發(fā)生在心尖部。這些現(xiàn)象說明該模型與已知病理反應(yīng)相符，也證明了IMC捕捉動(dòng)物模型心室壁細(xì)胞變化的能力。
圖3. 不同細(xì)胞類型的時(shí)空變化；(C) 根據(jù)表達(dá)量區(qū)分單細(xì)胞的UMAP圖；(D)熱圖顯示心肌細(xì)胞細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)各區(qū)域的量；(E)熱圖顯示內(nèi)皮細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)各區(qū)域的量；(F)IMC圖片顯示不同時(shí)間點(diǎn)的心肌細(xì)胞和纖維化標(biāo)志物；(G) 各時(shí)間點(diǎn)各區(qū)域纖維化打分
接下來，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了細(xì)胞社群分析，利用細(xì)胞間空間位置數(shù)據(jù)將細(xì)胞分成23類不同的群落（community clusters, CCs）。其中大多數(shù)群落中的主要細(xì)胞類型為心肌細(xì)胞，有三類群落中最多的是成纖維細(xì)胞，另有三類相對(duì)富集內(nèi)皮細(xì)胞和三類相對(duì)富集平滑肌細(xì)胞的群落。分析發(fā)現(xiàn)細(xì)胞群落與局部組織結(jié)構(gòu)有明顯關(guān)聯(lián)，集中體現(xiàn)在不同群落距離不同類型血管的遠(yuǎn)近上。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步比較了健康心臟與再灌注損傷后細(xì)胞群落的變化，發(fā)現(xiàn)損傷后細(xì)胞群落快速改變，而梗死區(qū)域、邊緣區(qū)域和遙遠(yuǎn)區(qū)域的變化趨勢(shì)并不相同。這不僅揭示了再灌注損傷后病理反應(yīng)的異質(zhì)性，也再次說明了研究不同解剖位置的重要性。
圖4. 細(xì)胞群落鑒定；(A)群落分析示意圖；(B)23類群落的tSNE圖；(C)不同群落的細(xì)胞組成；(D)代表性的IMC及對(duì)應(yīng)群落圖像
圖5. 再灌注損傷后細(xì)胞群落快速變化；(A)不同區(qū)域各群落隨時(shí)間的變化；(B)聚類分析顯示每個(gè)時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)一種群落模式，說明群落隨時(shí)間快速變化；(C)再灌注損傷后梗死、邊緣和遙遠(yuǎn)區(qū)域顯著改變的群落
為了揭示再灌注損傷后關(guān)鍵的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與表觀遺傳學(xué)變化，研究人員利用IMC的多靶標(biāo)panel分析了7種磷酸化蛋白和14種組蛋白翻譯后修飾事件。信號(hào)通路激活也表現(xiàn)出區(qū)域特異性，以梗死的邊緣區(qū)域最為明顯。時(shí)間軸上，RAS-ERK通路被迅速激活，而其他通路在至少一天后才有明顯激活，說明它們?cè)趽p傷修復(fù)等過程中可能有作用。與此相對(duì)的是，信號(hào)通路激活的區(qū)域通常對(duì)應(yīng)著較少的組蛋白修飾。
研究者接下來使用無(wú)監(jiān)督聚類分析產(chǎn)生了13類翻譯后修飾簇（posttranslational modification intensity (PTMI) subgroups），用以進(jìn)一步確立與時(shí)空關(guān)聯(lián)的細(xì)胞特異性翻譯后修飾特征。其中，再灌注損傷中期的翻譯后修飾簇中富集內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞群落含量明顯增加，說明內(nèi)皮細(xì)胞的信號(hào)通路與表觀遺傳學(xué)改變對(duì)再灌注損傷進(jìn)展至關(guān)重要。而晚期變化則與成纖維細(xì)胞主導(dǎo)的細(xì)胞群落相關(guān)。
圖6. 信號(hào)通路與表觀遺傳調(diào)節(jié)；(A)各區(qū)域各時(shí)間點(diǎn)的翻譯后修飾信號(hào)強(qiáng)度；(B)IMC圖片顯示翻譯后修飾信號(hào)改變；(C) 13類翻譯后修飾簇的UMAP顯示；(D)聚類分析將翻譯后修飾信號(hào)分為三大類（PTMI_KC），分別對(duì)應(yīng)不同時(shí)間區(qū)段
通過深入分析再灌注損傷中期的翻譯后修飾變化，研究人員發(fā)現(xiàn)梗死和邊緣區(qū)域的內(nèi)皮細(xì)胞中H3K9me3明顯升高。為了驗(yàn)證H3K9me3的作用，他們使用了經(jīng)體外編輯后降低了H3K9甲基化的內(nèi)皮細(xì)胞。注射有這種內(nèi)皮細(xì)胞的小鼠心臟在再灌注損傷后射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)明顯改善，血管生成增多，而纖維化明顯降低。其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了H3K9me3直接調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能基因的表達(dá)。因此，H3K9me3有望成為再灌注損傷干預(yù)的新靶點(diǎn)。
圖7. 降低內(nèi)皮細(xì)胞H3K9me3改善再灌注損傷結(jié)果；(A)三大類翻譯后修飾信號(hào)群中細(xì)胞類型（左）和PTMI_KC3中細(xì)胞群落組成（右）；(B)內(nèi)皮細(xì)胞各PTMI中翻譯后修飾信號(hào)強(qiáng)度；(C)注射編輯后內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)流程；(D)體外編輯降低H3K9me3強(qiáng)度；(E)降低內(nèi)皮細(xì)胞H3K9me3后射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)明顯改善
這篇文章是IMC在心血管疾病領(lǐng)域的極佳應(yīng)用案例。研究團(tuán)隊(duì)利用IMC通道多、背景低等特點(diǎn)，對(duì)心肌梗死再灌注損傷后各解剖區(qū)域和時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行了全面的單細(xì)胞分析，并克服了單細(xì)胞測(cè)序等手段的不足，探究了疾病相關(guān)的細(xì)胞群落、信號(hào)通路和表觀遺傳學(xué)變化，并最終發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞特異的新潛在治療靶點(diǎn)。在此，我們對(duì)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院阜外醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)表示衷心的祝賀！?
參考文獻(xiàn)：
Spatial Multiplexed Protein Profiling of Cardiac Ischemia-Reperfusion Injury. Circ Res. 2023 Jun 23;133(1):86-103. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.123.322620.