單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)（single-cell proteomics, SCP）是一種專(zhuān)注于解析單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)組成和功能的前沿分析技術(shù)。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)能夠提供更細(xì)致的細(xì)胞層面信息，有效揭示單細(xì)胞之間的內(nèi)在異質(zhì)性，與傳統(tǒng)的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)相比，彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法僅提供樣本總體或平均表達(dá)水平的不足。在植物研究中，單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)突破了因細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)導(dǎo)致傳統(tǒng)技術(shù)難以解析單一植物細(xì)胞蛋白質(zhì)的局限性，可揭示植物細(xì)胞間異質(zhì)性，深入解析植物基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和細(xì)胞功能特性。基于此，2024年愛(ài)荷華州立大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)以擬南芥為模型，通過(guò)單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)成功區(qū)分了根部?jī)?nèi)胚層和皮層細(xì)胞，為植物單細(xì)胞研究提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持。作為專(zhuān)業(yè)服務(wù)商，百泰派克生物科技利用全流程集成自動(dòng)化的單細(xì)胞分選平臺(tái)——CellenONE，為科研人員提供高質(zhì)量、精準(zhǔn)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析服務(wù)，為解決植物研究中復(fù)雜細(xì)胞異質(zhì)性問(wèn)題提供創(chuàng)新解決方案。
擬南芥是植物學(xué)中常用的模式植物，因其根系細(xì)胞類(lèi)型明確且分布規(guī)律，成為研究植物細(xì)胞異質(zhì)性的理想模型。根系是植物重要的吸收和運(yùn)輸器官，其不同細(xì)胞類(lèi)型在生理功能和響應(yīng)外界刺激上各有不同。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)方法無(wú)法精確區(qū)分根系中不同細(xì)胞類(lèi)型之間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，而單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)為此提供了一種創(chuàng)新的解決方案。愛(ài)荷華州立大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)擬南芥根細(xì)胞類(lèi)型的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析，為深入理解植物根系的功能分化及其在環(huán)境適應(yīng)中的作用提供了理論依據(jù)，以下是其主要研究結(jié)果：
一、方法學(xué)改進(jìn)及數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估
擬南芥的根是一個(gè)特征明確的器官，具有明確的細(xì)胞類(lèi)型，使其成為植物SCP基準(zhǔn)的優(yōu)秀系統(tǒng)。選擇關(guān)注兩種細(xì)胞類(lèi)型，皮層和內(nèi)胚層，這兩種細(xì)胞來(lái)源于一種常見(jiàn)的干細(xì)胞譜系。在根內(nèi)，這兩種細(xì)胞類(lèi)型在物理上彼此相鄰（圖1）。根部被酶解釋放原生質(zhì)體，然后分別用流式細(xì)胞儀分離內(nèi)胚層或皮層原生質(zhì)體。最終，每種細(xì)胞類(lèi)型的384個(gè)原生質(zhì)體放置在384孔板上。
圖1. 擬南芥內(nèi)胚層和皮層單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)方法
使用改進(jìn)的方法進(jìn)行前處理和標(biāo)記上機(jī)，分析756個(gè)單個(gè)細(xì)胞。所得到的原始數(shù)據(jù)最初使用MaxQuant進(jìn)行搜索，評(píng)估了數(shù)據(jù)的靈敏度和一致性（圖2）。最終鑒定了3763個(gè)蛋白質(zhì)，平均每個(gè)細(xì)胞1118個(gè)蛋白質(zhì)。
圖2. 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)估
計(jì)算肽變異系數(shù)（CV），并去除具有極端肽CV（> 0.69）的細(xì)胞。還去除了在< 98%的細(xì)胞中定量的蛋白質(zhì)，以生成嚴(yán)格的過(guò)濾列表。雖然這種嚴(yán)格的過(guò)濾將細(xì)胞數(shù)量減少到81個(gè)（33個(gè)內(nèi)胚層細(xì)胞和48個(gè)皮層細(xì)胞），但能夠在這些細(xì)胞中量化3217個(gè)蛋白質(zhì)。推測(cè)這可能是由于根細(xì)胞大小的差異（每個(gè)細(xì)胞的總蛋白）導(dǎo)致的，因?yàn)檠刂拈L(zhǎng)度存在細(xì)胞大小的梯度。此外，包括根在內(nèi)的許多植物組織中的細(xì)胞都經(jīng)歷了基因組內(nèi)重復(fù)。雖然這通常會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞變大，但細(xì)胞大小的增加是非線性的，這表明在植物SCP研究中，鑒定組蛋白以外的正常化因子是必要的。細(xì)胞大小可變性可能導(dǎo)致定量變化的問(wèn)題也可以在未來(lái)使用能夠不僅基于熒光而且基于細(xì)胞大小/形態(tài)進(jìn)行分選的儀器進(jìn)行研究，例如cellenONE。
二、數(shù)據(jù)檢查
對(duì)定量蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以探索SCP檢測(cè)到的蛋白的特征。首先觀察SCP是否檢測(cè)同源轉(zhuǎn)錄物高度豐富的蛋白質(zhì)。繪制了擬南芥根系單細(xì)胞RNA-seq圖譜中檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本，發(fā)現(xiàn)在SCP中檢測(cè)到的蛋白質(zhì)跨越了低到高豐度轉(zhuǎn)錄本的范圍，并偏向于豐富的轉(zhuǎn)錄本。最后，檢查了SCP是否量化與信號(hào)相關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)通常含量較低。具體來(lái)說(shuō)，檢查了是否量化了激酶和轉(zhuǎn)錄因子。在3217個(gè)定量蛋白中，觀察到175個(gè)激酶和188個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，表明信號(hào)相關(guān)蛋白很容易通過(guò)SCP測(cè)量。
三、結(jié)果分析
接下來(lái)，研究了嚴(yán)格過(guò)濾組的內(nèi)胚層和皮層細(xì)胞蛋白質(zhì)組的差異。前25%最易變蛋白的PCA和UMAP顯示了內(nèi)胚層和皮層細(xì)胞之間的明顯分離（圖3）。
圖3. PCA和UMAP圖
還進(jìn)行了差異表達(dá)分析，并鑒定出596種蛋白在內(nèi)胚層和皮層細(xì)胞中差異積累(圖4a)。在預(yù)期的細(xì)胞類(lèi)型中觀察到已知蛋白的富集（圖4a）。例如，CASPARIAN STRIP MEMBRANE DOMAIN PROTEIN 1在內(nèi)胚層細(xì)胞中富集，這與它作為參與CASPARIAN STRIP （CS）形成的內(nèi)胚層標(biāo)記物的已知作用一致。此外，YUCCA 2中的NAKED PINS在內(nèi)胚層細(xì)胞中富集，據(jù)報(bào)道，它可以控制PIN-FORMED 1亞細(xì)胞的基底定位和根向地性反應(yīng)。研究還發(fā)現(xiàn)了內(nèi)胚層細(xì)胞富含呼吸爆發(fā)氧化酶同源物D，已知在內(nèi)胚層細(xì)胞中激活活性氧依賴的信號(hào)以幫助CS形成。
圖4. 差異表達(dá)分析
在皮層內(nèi)，幾個(gè)關(guān)鍵的標(biāo)記蛋白被富集。這包括生長(zhǎng)素反應(yīng)因子5，已知其可驅(qū)動(dòng)皮質(zhì)細(xì)胞分裂。共伴侶蛋白P23-1也在皮質(zhì)細(xì)胞中富集，該蛋白在建立生長(zhǎng)素分布和維持皮質(zhì)細(xì)胞適當(dāng)數(shù)量方面發(fā)揮了重要作用。最后，研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體19S調(diào)節(jié)顆粒8a在皮質(zhì)中富集，已知它可以影響B(tài)RAHMA的穩(wěn)定性，從而促進(jìn)硼耐受性。為了識(shí)別兩種細(xì)胞類(lèi)型中鑒定的蛋白質(zhì)之間的共同和獨(dú)特特征，對(duì)兩種細(xì)胞類(lèi)型（列）和蛋白質(zhì)（行）進(jìn)行了分層聚類(lèi)（圖4b）。該分析顯示，來(lái)自內(nèi)胚層的細(xì)胞傾向于聚集在一起，來(lái)自皮層的細(xì)胞也是如此，這表明基于細(xì)胞起源的明顯聚類(lèi)（圖4b）。
近年來(lái)，樣品制備、液相色譜和質(zhì)譜技術(shù)的進(jìn)步顯著提高了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組的檢測(cè)能力，將蛋白質(zhì)檢測(cè)能力從幾百個(gè)提高到幾千個(gè)。在這一背景下，愛(ài)荷華州立大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)成功地利用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析了擬南芥根部不同細(xì)胞類(lèi)型的蛋白質(zhì)表達(dá)譜，結(jié)果表明單細(xì)胞蛋白質(zhì)組可區(qū)分?jǐn)M南芥根細(xì)胞類(lèi)型，這不僅證明了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)在植物中的可行性，也揭示了植物根部細(xì)胞類(lèi)型間復(fù)雜的蛋白質(zhì)調(diào)控機(jī)制。
作為一家專(zhuān)注于生物制品表征和多組學(xué)生物質(zhì)譜檢測(cè)的高品質(zhì)服務(wù)商，百泰派克生物科技致力于為客戶提供專(zhuān)業(yè)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析服務(wù)。憑借豐富的經(jīng)驗(yàn)和先進(jìn)的技術(shù)，我們?yōu)橹参镅芯刻峁└哔|(zhì)量的數(shù)據(jù)支持。無(wú)論是深入解析植物細(xì)胞類(lèi)型，還是精準(zhǔn)測(cè)定復(fù)雜生物體系中的蛋白質(zhì)表達(dá)差異，百泰派克生物科技都能為您量身定制解決方案，助力您的科研突破。
參考文獻(xiàn)：Montes C, Zhang J, Nolan TM, Walley JW. Single-cell proteomics differentiates Arabidopsis root cell types. New Phytol. 2024 Dec;244(5):1750-1759. doi: 10.1111/nph.19923. Epub 2024 Jun 24.
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單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析服務(wù)
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