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??? 細胞樣本的前處理

??? 一、勻漿介質(zhì)

??? 一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS),客戶可根據(jù)樣本及測定指標的情況自行設定濃度,目的是保持樣本的等滲環(huán)境。

??? 二、細胞樣本的前處理:

??? 1、細胞沉淀的收集：

??? ①懸浮細胞:對于懸浮培養(yǎng)的細胞，直接通過離心收集細胞沉淀，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

??? ②貼壁細胞:對于貼壁培養(yǎng)的細胞，用胰酶將細胞消化下來，或用細胞刮將細胞刮下來，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

??? 我們一般建議客戶，細胞密度最好不要小于一百萬個/ml。

??? 2、細胞沉淀的洗滌：

??? 在細胞沉淀中加入0.5-1ml的PBS（等滲），輕輕顛倒混勻，將培養(yǎng)液在室溫條件下1000轉(zhuǎn)/分,離心10分鐘，棄上清留細胞沉淀。

??? 重復上述操作反復洗滌1～2次。

??? 3、勻漿的方式：手工勻漿，超聲破碎,裂解液裂解,反復凍融。

??? ①手工勻漿：在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，用移液器將細胞懸浮液移至玻璃勻漿管中（2ml玻璃勻漿管），將玻璃勻漿管置于冰水混合物中，手動勻漿3分鐘，然后取破碎好的細胞懸浮液進行測定。

??? ②超聲破碎:

??? 在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，在冰水浴條件下進行如下操作:

??? a、用超聲粉碎機進行粉碎，可用Soniprep150型超聲波發(fā)生器以振幅14微米超聲處理30秒使細胞破碎，也可用國產(chǎn)超聲波發(fā)生儀，用400安培，5秒/次，間隙10秒反復3～5次。

??? b、用超聲細胞破碎儀，300W功率，每次超聲3～5秒，間隔30秒，重復4～5次。

??? ③裂解液裂解

??? 常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,這三種去垢劑的作用是不同的，或者說作用力量強弱不同。

??? 1、SDS屬于離子型去垢劑，最厲害，基本可以把細胞完全破掉，DNA會釋放出來，裂解液變得很粘稠。

??? 2、NP-40是很溫和的去垢劑，1%濃度的基本可以破壞掉胞膜，而對核膜破壞的作用弱，結(jié)合特定的buffer可以獲得胞漿蛋白。

??? 3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之間，偏向于NP40，也是常用的細胞裂解液成分之一，在保護蛋白活性方面有一定作用（SDS基本會使蛋白變性失活）。

??? 去垢劑屬性只是一方面，buffer、配比、濃度、提取方法和材料處理也都是關(guān)鍵因素

??? 由于很多裂解液都是蛋白變性劑,對酶活力的測定有一定的影響,一般不推薦用裂解液進行裂解。

??? ④反復凍融:

??? 在細胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根據(jù)所測指標的不同而有所改變，一般加入0.5ml，細胞密度不小于一百萬個/ml），混勻，將細胞懸浮于PBS中，放低溫冰箱中結(jié)冰，溶解，再結(jié)冰，再溶解，反復3次左右）。

??? 由于反復凍融對酶活力影響較大,一般不推薦使用.