腺相關病毒（Adeno-associated virus, AAV）是表達基因序列的理想載體，由于其種類多樣、免疫原性低、擴散能力強、宿主范圍廣等優勢在基因功能研究和基因治療遞送載體中占據主導地位。目前FDA已批準了兩款基于AAV的基因治療藥物，近年來，隨著對AAV衣殼開發和基因組優化的研究深入，更加推動了AAV在基因研究和基因治療領域的應用。
腺相關病毒載體
腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）是微小病毒科（Parvoviridae）家族的成員之一，是一類無法自主復制、無被膜、具有二十面體結構的微小病毒，其直徑約20-26nm，含有4.7kb左右的線狀單鏈DNA作為基因組。
重組腺相關病毒載體（recombinant AAV, rAAV）是在非致病的野生型AAV基礎上改造而成的基因載體，研究中采用的rAAV通常為AAV2型基因組與不同的衣殼蛋白結合產生的混合體病毒載體。
rAAV載體空殼率
隨著rAAV載體的基礎研究、臨床前研究和臨床研究的不斷深入，在rAAV載體制備過程中，產品質量穩定性、純度是產品質控的重要內容。
rAAV衣殼是由60個衣殼蛋白亞單位構成，排列成二十面體結構，包含載體DNA基因組。在rAAV載體制備過程中，除了含有全長DNA基因組的完整rAAV載體外，有一定比例的rAAV顆粒不含任何DNA基因組，被稱為空病毒顆粒。在Rep蛋白的參與下，組裝好的空病毒顆粒向核質遷移，而DNA的包裝則發生在已組裝完畢的空病毒顆粒遷移至核質后，這促進了形成空病毒顆粒的概率。
此外，還存在一定比例的含有部分DNA的病毒顆粒，DNA過度裝載的病毒顆粒，以及rAAV多聚體（圖1）。
圖1 rAAV制備過程中產生的病毒顆粒主要類型（圖片來源：參考文獻1）
rAAV載體空殼率高所帶來的影響
現有研究發現，大量空病毒顆粒的存在可能會影響rAAV載體的有效性和安全性，因為它們可能會增加rAAV載體的免疫原性，增加免疫毒性的風險，或通過競爭細胞表面受體結合位點、內吞作用及胞內過程，影響rAAV轉導效率。因此，在rAAV載體制備和純化過程中，優化生產工藝、建立有效的純化方法，以降低rAAV空病毒顆粒數，盡可能純化獲得含有全長DNA基因組的完整rAAV載體，確保rAAV載體安全、穩定、有效，是產品質控標準的重要一環。
如何獲得空殼率更低、更可控的載體？
目前對于去除rAAV載體中的空病毒顆粒主要是在病毒純化過程中實現的，策略依賴于rAAV載體和空病毒顆粒的物理性質差異。
密度梯度離心法（Density gradient ultracentrifugation, DGC）：空病毒顆粒（不含DNA基因組）和含有部分DNA的病毒顆粒在較低的密度區間聚集，因此借助碘克沙醇或氯化銫（CsCl）經過多次密度梯度離心后，可以很容易將空病毒顆粒與rAAV載體分離，DGC法目前適用于所有血清型的純化。
離子交換層析法（ion-exchange chromatography, IEC）：rAAV載體的等電點會比空病毒顆粒略低，因此借助IEC法可以將空病毒顆粒去除。IEC法目前在某些血清型載體（如rAAV1、2、6）中去除空殼效果不錯，然而對于不同血清型的rAAV載體可能需要建立不同的純化方法。
低空殼率rAAV大起底
空殼的腺相關病毒會為科學研究和基因治療藥物開發帶來不可控因素和風險，因此人們在不斷探索控制空殼rAAV載體產生的辦法?？諝AAV的形成與病毒生產時的質粒配比、細胞培養水平、rAAV出毒時間均有一定關系，而下游腺相關病毒純化過程更是減少空殼rAAV的重要核心環節。
基于12年、30000+的病毒載體生產經驗，和元生物持續優化病毒生產全流程，用更優化的質粒配比、病毒收獲時間，借助超離、超濾、層析、PEG沉淀等科研及工業生產中的整合純化工藝，持續降低rAAV載體包裝中的空殼率，可做到<5%空殼率（實際工作中通常<2%），為研究者提供更好的基因載體。
2021年，我們選擇同一載體、不同生產廠商的腺相關病毒，發起了空殼率雙盲測試，電鏡結果顯示，和元生物的腺相關病毒空殼率遠低于行業一線品牌。
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圖2 rAAV載體生產空殼率大比拼
為了更好地顯示和元生物AAV產品的屬性，我們選取大視野進行比較
圖3 和元生物rAAV載體生產空殼率
電鏡結果：包裝DNA基因組的病毒顆粒為實心顆粒（紅色箭頭）；空病毒顆粒中間存在空洞（黃色箭頭）
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參考文獻
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