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Southern Blot 實(shí)驗(yàn)指南

基本概念

原理：將待檢測(cè)的DNA分子用/不用限制性?xún)?nèi)切酶消化后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉(zhuǎn)移到**纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標(biāo)記物標(biāo)記的DNA或RNA探針進(jìn)行反應(yīng)。如果待檢物中含有與探針互補(bǔ)的序列，則二者通過(guò)堿基互補(bǔ)的原理進(jìn)行結(jié)合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，從而顯示出待檢的片段及其相對(duì)大小。
用途：檢測(cè)樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態(tài), 如是否有點(diǎn)突變、擴(kuò)增重排等。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、基因組DNA的制備

二、基因組DNA的限制酶切

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臎Q定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個(gè)電泳通道需要10-30μg的DNA。購(gòu)買(mǎi)的限制性?xún)?nèi)切酶都附有相對(duì)應(yīng)的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產(chǎn)品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA（1μg /μl）-------------------------------20 μg
10×酶切buffer --------------------------------4.0 μl
限制性?xún)?nèi)切酶（10U/μl）------------------5.0 μl
加ddH₂O 至----------------------500 μl

在最適溫度下消化1-3Hour。消化結(jié)束時(shí)可取5μl電泳檢測(cè)消化效果。若消化效果不好，可以延長(zhǎng)消化時(shí)間，但超過(guò)6 Hour已沒(méi)有必要。或者放大反應(yīng)體積，或者補(bǔ)充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質(zhì)，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解。

如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應(yīng)條件可以一致，則兩種酶可同時(shí)進(jìn)行消化；如果反應(yīng)條件不一致，則先用需要低離子強(qiáng)度的酶消化，然后補(bǔ)加鹽類(lèi)等物質(zhì)調(diào)高反應(yīng)體系的離子強(qiáng)度，再加第二種酶進(jìn)行消化。

三、基因組DNA消化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡(jiǎn)單，分離范圍廣（200bp-50kb），實(shí)驗(yàn)成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

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