Southern Blot 實驗指南

基本概念

原理：將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性并按其在凝膠中的位置轉移到**纖維素薄膜或尼龍膜上，固定后再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過堿基互補的原理進行結合，游離探針洗滌后用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。
用途：檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。

實驗步驟

一、基因組DNA的制備

二、基因組DNA的限制酶切

根據實驗目的決定酶切DNA的量。一般Southern雜交每一個電泳通道需要10-30μg的DNA。購買的限制性內切酶都附有相對應的10倍濃度緩沖液，并可從該公司的產品目錄上查到最佳消化溫度。為保證消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。消化的DNA濃度不宜太高，以0.5μg /μl 為好。具體操作如下：在1.5ml離心管中依次加入

DNA（1μg /μl）-------------------------------20 μg
10×酶切buffer --------------------------------4.0 μl
限制性內切酶（10U/μl）------------------5.0 μl
加ddH₂O 至----------------------500 μl

在最適溫度下消化1-3Hour。消化結束時可取5μl電泳檢測消化效果。若消化效果不好，可以延長消化時間，但超過6 Hour已沒有必要。或者放大反應體積，或者補充酶再消化。如仍不能奏效，可能的原因是DNA樣品中有太多的雜質，或酶的活力下降。

消化后的DNA加入1/10 體積的0.5M EDTA，以終止消化。然后用等體積酚抽提、等體積氯仿抽提，2.5倍體積乙醇沉淀，少量TE溶解。

如果需要兩種酶消化DNA，而兩種酶的反應條件可以一致，則兩種酶可同時進行消化；如果反應條件不一致，則先用需要低離子強度的酶消化，然后補加鹽類等物質調高反應體系的離子強度，再加第二種酶進行消化。

三、基因組DNA消化產物的瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖凝膠電泳是目前分離核酸片段最常用的方法，制備簡單，分離范圍廣（200bp-50kb），實驗成本低。下表列舉了不同濃度瓊脂糖凝膠能分離的DNA片段范圍。

表：不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍

1.