磁珠捕獲結合CE-LIF進行快速樣品制備和單抗藥N-端糖鏈的分析
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現代制藥領域增長最快的是生物治療性藥物。隨著大量原研生物藥的**即將到期，越來越多的生物仿制藥和生物改良藥產品，主要是單克隆抗體藥物（mAbs）正在開發中。這個全球新興的生物制藥市場需要高靈敏度和分辨率的生物分析技術對產品進行表征，包括分析重要的翻譯后修飾，如糖基化。在生物藥物產品開發鏈的各個環節，均需要快速表征的方法，而糖基化正是其中的一個關鍵質量屬性(CQA) 。因此在單克隆抗體藥物生產過程中的所有步驟，均應密切監測其糖型。
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單克隆抗體的糖基異構化主要取決于使用的宿主細胞系和表達條件。結構的多樣性包括是否存在核心糖鏈的巖藻糖基化、不同的半乳糖苷化和唾液酸化以及二等分的N-端乙酰葡糖胺的存在。Fc端的CH2區保守糖基化結構（圖1）影響生物活性、理化性質、抗體依賴的細胞毒性（ADCC）和補體依賴的細胞毒（CDC）。
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圖1. 左圖為IgG1的結構圖，右圖為Fc端CH2區保守的糖基化結構
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由于糖基參與所有關鍵的生物過程，因此糖型對于功能關系應視為質量源于設計（QBD）過程中的一部分。例如，核心巖藻糖基化是對ADCC的功能起到反作用的關鍵影響因素（較低的巖藻糖基化增強ADCC的功能）。二等分的N-乙酰葡糖胺GlcNAc的存在也會增加ADCC的功能。末端唾液酸化影響抗炎特性，而半乳糖基化提高CDC功能。在治療性抗體藥物中，對某些免疫原性糖殘基，如α1-3半乳糖和N-羥乙酰神經氨酸（Neu5Gc）的微量分析也是非常重要的。對所有這些糖基化特征的深入分析需要貫穿生產過程中的每一個步驟，從克隆篩選到轉染、細胞擴增、工藝過程開發生產和純化，如圖2所示?？赡苡绊懼亟M糖蛋白糖基化過程差異的因素有：宿主細胞系中加工酶的表達水平、單糖核苷酸供體的水平、細胞信號轉導途徑如細胞因子/荷爾蒙、培養基組分以及由于pH變化、基因突變、沉默和過表達造成的細胞器組織缺失和生物生產過程中的環境(溫度，氧含量等)。因此，使用適當的分析工具來確保產品具備必需的糖基化，對于保證產品最佳的活性是很關鍵的。
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圖2. 重組治療性抗體生產過程中涉及糖基化的主要步驟
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用于表征治療性蛋白N-端糖基化的方法有很多種，最常見的如毛細管電泳（CE），液相色譜（LC），質譜（MS）和核磁共振（NMR）。毛細管電泳技術（圖3）的優勢在于分離速度快，分辨率高和檢測靈敏高。一直以來，很多生物制藥企業利用毛細管電泳的多種模式結合紫外檢測或熒光檢測方法進行對單抗的表征，如毛細管區帶電泳表征單抗的純度和異質性，毛細管等電聚焦檢測單抗的等電點和電荷異質性，毛細管凝膠電泳用于糖基化分析。并且研究探索了上述各毛細管電泳方法在不同實驗室和不同操作人員間的可轉移性以及優異的穩定性。
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圖3. 配置激光誘導熒光檢測器的PA800 plus生物制藥分析系統
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本文將介紹一種磁珠輔助的樣品處理方法，對治療性單克隆抗體N-端糖基化進行快速的分析。所有的樣品制備過程都可使用自動化的液體處理器完成，無需離心和過夜孵育。全部樣品制備過程僅需要不到四個小時即可完成。
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實驗設計
化學試劑：IgG，醋酸，***鈉（1M in THF）購于Sigma Aldrich （St. Louis, MO），8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽（APTS），N-CHO Carbohydrate分離膠緩沖液，麥芽低聚糖標準品和Agencourt CleanSEQ 磁珠由貝克曼提供，PNGase F酶由ProZyme提供，酶解反應混合物按照廠家的說明書準備。
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樣品制備：根據廠家提供的PNGase F反應說明書，用PNGase F快速酶解糖基，50℃孵育1小時。之后加入200 μL磁珠（Agencourt CleanSEQ）的乙*懸浮液（最終乙*濃度為87.5%），磁珠可從多肽鏈和糖類內切酶的混合物中將酶切下來的糖基捕獲。通過充分混合，將含有糖基磁珠混合物的離心管放入強磁場中進行快速分離。棄去上清液，向離心管中加入21 μL的APTS（40 mM于20%的醋酸中），以洗下捕獲在磁珠上的寡糖鏈。
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洗脫結束后立刻加入7 μL***鈉（1M in THF）進行還原胺化反應。反應混合物在37℃孵化2小時，然后用酶解反應中相同的磁珠 （Agencourt CleanSEQ）去除多余的染料，乙*的最終濃度為87.5%。棄去上清液，加入25 μL水，將離心管放置在強磁場中，將APTS標記的糖基從磁珠上洗脫下來。含有APTS標記糖基的上清液用于CE-LIF分析。
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毛細管電泳：實驗使用的毛細管電泳儀為PA800 plus（由AB SCIEX提供），配置激光誘導熒光檢測系統（激發波長488 nm，發射波長520 nm）。N-CHO分離毛細管的有效長度為50 cm（60 cm毛細管總長，50 μm內徑）。施加的電場強度為500 V/cm，運用反向電壓（進樣端為陰極）。1psi（6.89 kPa）壓力進樣5秒。用32 karat工作站進行數據的采集和分析。
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結果和分析
單克隆抗體的全面糖基化分析是一項具有挑戰的任務，因為糖類通常具有非常復雜、多樣化的結構。此外它們不具備任何的生色和熒光基團，不能使用液相分離技術的常規的檢測手段進行檢測。此外，大部分糖基結構不帶電荷，在電場下很難進行分離。糖基檢測的方法有核磁共振、質譜、高效液相色譜、毛細管電泳或聯用技術（LC-MS，CE-MS）。其中，毛細管電泳結合激光誘導熒光檢測可以很容易的解決上述問題，提供耐用、高效和高重現性的糖型分析方法。毛細管電泳的快速分析也適用于高通量的分離模式。與LC和大多數基于質譜檢測的方法相似，使用毛細管電泳技術也需要進行樣品的分離前的標記。APTS是毛細管電泳中最常用于糖分析的標記物，它可以在快速電泳遷移中提供熒光信號和分離必需的電荷。APTS與糖通過簡單的一步反應形成的穩定結合物，APTS只能與糖的還原末端反應，因此保證了定量準確性（每個糖鏈結合一個熒光分子）。APTS的熒光特性使其可以使用PA800 plus中的488 nm激發的激光誘導熒光進行檢測。
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糖基的釋放和熒光標記：首先要用合適的酶，PNGase F，將糖基從多肽上切割下來。針對于樣品制備的要求，進行了孵育時間和溫度的優化。糖基釋放的優化條件是50℃孵育1小時。
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