單細胞蛋白質組學（Single-Cell Proteomics, SCP）是當前生物學領域最前沿的研究方向之一，專注于解析單細胞層面的蛋白質表達譜及其動態變化。傳統蛋白質組學技術主要面向群體或組織水平，難以揭示單個細胞的異質性。然而，細胞群體的異質性對組織功能、生物學機制乃至疾病發展起著重要作用，因此迫切需要針對單細胞層面的精準檢測工具。近年來，基于質譜技術的單細胞蛋白質組學取得了顯著進展，其檢測靈敏度和通量不斷提高，但在單個細胞內實現數千種蛋白質的高重復性定量依然面臨諸多挑戰。為此，麻省理工學院和哈佛大學布羅德研究所的Steven A. Carr和Claudia Ctortecka團隊提出了一個專用的樣品制備芯片--proteoCHIPEVO96技術，并結合Evosep One液相色譜系統，實現了高效、高通量、低損耗的單細胞蛋白質組學分析平臺。proteoCHIP EVO 96技術的應用不僅推動了單細胞蛋白質組學領域的發展，還為研究復雜的生物學問題提供了全新的解決方案。作為生物質譜檢測優質服務商，百泰派克生物科技致力于為廣大科研工作者提供先進的高質量單細胞蛋白質組學分析一站式服務。
基于proteoCHIP EVO 96的全新工作流程，通過將單細胞樣品直接轉移到Evosep系統進行在線脫鹽和分離，顯著提高了蛋白質檢測的深度與通量，并展示了其在單細胞水平上解析復雜生物現象的能力。該技術還支持全自動化操作，優化了單細胞樣品的制備與進樣流程。此外，2024年7月麻省理工學院和哈佛大學布羅德研究所團隊于《Nature Communications》中發布了其關鍵研究結果與技術亮點：
1、proteoCHIP EVO 96最大限度地減少吸附肽損失
proteoCHIP EVO 96是一種微機械低吸附PTFE芯片，在96孔板的布局中具有錐形納米孔。納米空中提前注入 3 μL 十六烷。在這個納米孔中進行樣本的蛋白提取和酶切，減少了由于移液或樣品轉移而導致的吸附損失。同時將proteoCHIP EVO 96與Evotips盒的頂部連接，通過改變proteoCHIP EVO 96的溫度，使液體樣品滴與固體十六烷完全分離（以在每個Evotip適配到每個納米孔，其與高效液相色譜系統中用于在線脫鹽的一次性捕集柱Evosep One高效液相色譜系統偶聯）從而達到一個自動化進樣的目的。
該研究利用5個細胞樣本同時用手動進樣和自動化進樣的方法來評估樣品轉移方式對肽回收率的影響（圖1a），結果發現手動進樣的樣品每次分析運行產生的蛋白質組的中位數為 582 種，而自動化進樣 Evotips 的蛋白質組中位數為每個單細胞 812 種蛋白質；手動進樣沒有丟失具有特定疏水指數（GRAVY）的肽，但自動化進樣的結果中檢測到了豐度較低的肽（圖1c)；兩種樣品轉移策略之間的獨特肽序列重疊率為99%，而自動化進樣的樣品中只有37個獨特的肽。這證明了通過proteoCHIP EVO 96的專用設計直接轉移樣品的好處。
該研究基于圖1b和c中使用的默認胰酶ddaPASEF獲取策略進一步優化了timsTOF獲取方法，發現將樣品直接上樣與40SPD Evosep One分離方法相結合，可回收約2倍的蛋白質，并將樣品通量提高30%。
此外，該研究評估了使用直接Evosep-與手動nanoElute方法獲得的基于proteoCHIP EVO 96的單細胞樣品的數據完整性和動態范圍的差異性(圖1e, f)，發現與手工nanoElute方法相比，使用直接轉移的Evosep樣品的數據完整性提高了12%(圖1e)。除了增加肽回收率和減少缺失外，直接轉移的Evosep樣品與手動nanoElute樣品相比顯示出相似的動態范圍(圖1f)。使用手動nanoElute或直接Evosep方法，proteoCHIP EVO 96制備的SCP樣品具有接近5個數量級的相似肽段(圖1f)。與獲取ddaPASEF相比，diaPASEF在直接Evosep SCP樣品中獲得的前體豐度高于手動nanoElute(圖1c vs. f)。基于此，研究團隊假設專用diaPASEF采集策略的速度提高與40SPD的峰值容量相結合，使研究團隊能夠在整個動態范圍內更有效地采樣前體(圖1f)。
圖1. 直接進樣 VS 手動進樣
2、高通量檢測的條件仍可鑒定到3500種蛋白質
大多數標準的SCP項目需要獲得數百到數千個單細胞來解決組織或群體的異質性，并了解潛在的生物學特性。然而，較短的色譜分離時間對timsTOF SCP的采集速度和有效離子利用率提出了挑戰。該研究選用40SPD和80SPD都以100 nL/min的速度分離肽，使用5 cm Aurora Rapid柱，80SPD的通量增加了2倍，結果發現幾乎所有用80SPD鑒定的蛋白都可以用40SPD方法鑒定，這證明了該研究團隊的SCP工作流程和獲取策略的可重復性(圖2b)。
接下來用40SPD和80SPD方法研究了定量蛋白的總體豐度。該研究使用80SPD分離方法增加的通量使單細胞分析的動態范圍減小了一個數量級(圖2c)，選用了E3泛素連接酶作為關注蛋白來研究這種減少對蛋白質鑒定和定量的影響。具體來說，使用40SPD方法，該研究團隊在單個細胞中鑒定了50多個E3泛素蛋白連接酶，而使用80SPD方法回收了13個(圖2c)。雖然使用80SPD方法檢測到的連接酶的強度降低了近一個數量級，但兩種方法之間的豐度等級順序保持不變(圖2c)?；?0SPD方法鑒定的數量和動態范圍減少，但鑒定的蛋白幾乎完全重疊，該研究團隊推測未觀察到的蛋白豐度較低。實際上，在40SPD中MS1豐度小于1e3的蛋白在80SPD中普遍低于檢測限(圖2d)。此外，在較短的梯度中更頻繁的前體共分離增加了MS/MS掃描的復雜性，并可能導致低豐度前體的信號抑制(圖2e)。這表明在降低分析深度的情況下，2倍高的單細胞分析通量是可行的。
圖2. 提高通量的蛋白鑒定結果的影響
3、驗證LPS誘導的蛋白質組變化在單細胞中的變化
已知脂多糖(LPS)在多種細胞中刺激炎癥、產生細胞因子和激活代謝反應。該研究團隊研究了基于proteoCHIP EVO 96的SCP工作流程是否可以用于在單細胞水平上分析LPS刺激的影響。為此，選用200 ng/mL LPS (n = 77)和DMSO對照(n = 84)處理常用的人白血病單核細胞系(THP-1 13.7µm) 12小時。處理后的細胞用該研究團隊的proteoCHIP EVO 96工作流程處理，轉移到Evotips上，并在timsTOF Ultra上用40SPD方法采集數據(圖3a)。鑒定了多達1537個蛋白質組，每個細胞中位數為1149個蛋白質組(圖3b)，鑒定的蛋白質數量結果與圖2a中所示的HEK-293T（26.7µm）細胞相比，由于細胞體積發生變化，單個細胞的蛋白質鑒定種類相對減少(圖2a，圖3b)；對兩組樣本鑒定到的蛋白進行差異分析，結果發現，與DMSO對照相比，LPS處理的細胞中有214個蛋白顯著上調，而15個蛋白顯著下調(圖3d；基因集富集分析(GSEA)結果顯示LPS處理后的基因集富集通路調節了與干擾素信號通路以及白細胞介素信號等炎癥通路有關的蛋白質，特別是白細胞介素-12家族，這與LPS的已知作用一致(圖3e)。
圖3. 40SPD體系應用于單細胞蛋白組學結果分析
該研究利用專門設計的芯片（cellenONE和proteoCHIP EVO 96）進行樣品處理。通過與Evosep One色譜系統的直接接口，實現了在線脫鹽和高度可重復的分離，這與Bruker timsTOF相結合，證明了沒有人工樣品處理的雙重識別，最新一代的timsTOF Ultra識別多達4000個，平均每個HEK-293T能鑒定到3500個蛋白質組；同時，該研究還通過高度可重復的單細胞蛋白質組學工作流程，對數百個脂多糖（LPS）擾動的THP-1細胞進行了分析，并鑒定了涉及白細胞介素和干擾素信號傳導的關鍵調節蛋白質。證明了使用timsTOF Ultra進行的基于proteoCHIPevo96的樣品制備提供了足夠的蛋白質組深度，以研究細胞類型分類之外的復雜生物學。
proteoCHIP EVO 96技術通過其創新設計和與Evosep One的完美結合，在提升樣品制備效率、檢測深度和通量的同時，顯著減少了手動操作帶來的誤差，為單細胞蛋白質組學研究開辟了新路徑。無論是在基礎研究中探討細胞功能的異質性、炎癥反應解析以及藥物靶標發現等領域，還是在臨床研究中開發個性化診療方案，該技術都展示出了廣闊的應用前景，為探索生命奧秘和攻克疑難疾病提供了強有力的支持，推動了單細胞蛋白質組學高效發展。
基于Thermo Orbitrap Astral高分辨質譜儀和Bruker timsTOF HT設備，結合全流程集成自動化的單細胞分選平臺CellenONE，百泰派克生物科技提供精準且高效的單細胞蛋白質組學分析服務。不論是高通量細胞分析還是復雜樣品的深度研究，百泰派克生物科技都能為您提供精確可靠的數據支持，定制化的解決方案，為您的科研保駕護航。
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