通過間接ELISA法來確定抗原最佳包被濃度 (方陣滴定，也叫棋盤滴定法) 。下面以兔高免血清多抗效價檢測為例

1. 抗原用包被緩沖液CBS (0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)按1μg/ml濃度用作連續1:2倍比稀釋，每個稀釋度包被一行（12孔/行）,100μl/孔加入酶標板中，覆膜密封（防止水分揮發）4℃包被過夜(12h以上)。

2. 次日甩掉板中液體，在吸水紙上拍干板子，每孔加入150μl封閉液(含2% BSA的包被緩沖液CBS），室溫（25℃） 2h以上。

3. 用洗滌液PBST[含0.05% Tween-20的PBS(pH7.4)]洗板3次，此時將待測高免陽性血清和空白陰性血清用抗體稀釋液（含1% BSA的PBS緩沖液,pH7.4）分別從1:500開始做連續1:2倍比稀釋，按下圖分布模式100μl/孔，37℃ 1h。

4. 取出拍干，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl二抗工作液（用抗體稀釋液1:3000稀釋HRP標記羊抗兔IgG，Frdbio，Cat No.:SAB90200H）,37℃孵育1h。

5. 取出拍干，洗滌液洗板3次，每孔加入100μl單組份TMB底物（Frdbio,Cat No.:ELS0010），室溫孵育5～20min（根據顏色的改變速度）。

6. 每孔加入50μl終止液（0.5M H2SO4）。

7. 在酶標儀上讀取450nm/630nm的吸光度。

標準的結果分布模式應該如上圖所示： ELISA酶標板顯色由陰陽性區域第一行第一列孔向外顯均勻放射狀遞減；如果在包被梯度方向上OD450過高無梯度，應該繼續降低包被濃度；反之，則增加。同理，如果在免疫血清稀釋度方向上OD450過高無梯度，則應繼續加大稀釋度，反之，則減小。

8. 最佳包被濃度的確定:

陽性血清區域內某個孔對應的OD值與其上/其左孔OD值恰好為2倍關系且OD值不低于1.2,且此孔對應的陰性血清區域OD值與空白對照孔OD值無差異，此孔包被的抗原濃度的2倍確定為抗原的最佳包被濃度。同理也可以參照此方法確定陽性血清的最佳稀釋倍數。

如果方陣滴定的數值結果不能如圖分布，則需要重新設計方陣實驗。

9. 以最佳包被濃度將抗原按照上述方法包被到酶標板同時封閉，將陰性/陽性血清依次倍比稀釋，100μl加到酶標板孔（最好做復孔），然后依次加入二抗、底物顯色，讀取OD值。

對應稀釋度陰性血清OD值的2.1倍確定為陽性值，也稱Cut-off值，這個是檢驗學上的常用方法，而往往制備抗體的高免血清的稀釋度都比較高，其對應稀釋度的陰性血清值接近于空白值，所以這個判斷方法作為ELISA稀釋終點沒有意義，Frdbio定義ELISA終點方法為：OD值-空白值或陰性對照值≧0.100（前提條件是空白孔值/陰性對照孔OD值﹤0.050），可以根據自己的實驗室具體情況自己確定合適的終點判定標準。