說(shuō)到抗體標(biāo)記，我們首先提一個(gè)廣義的概念:蛋白質(zhì)標(biāo)記；蛋白標(biāo)記應(yīng)該分為結(jié)合（Binding）和偶聯(lián)（Conjugation），結(jié)合又分為特異性結(jié)合(specific binding)和非特異性結(jié)合(non-specific binding)，非特異性結(jié)合在百度百科上的定義是：某種配體與其相對(duì)應(yīng)的特異性結(jié)構(gòu)位點(diǎn)外其他無(wú)關(guān)物質(zhì)(如非特異性蛋白質(zhì)、容器、分離材料等)的結(jié)合，其特點(diǎn)是親和力低而結(jié)合容量大。非特異性結(jié)合比較典型的例子是膠體金標(biāo)記，膠體金標(biāo)記，實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過(guò)程，吸附機(jī)理是膠體金顆粒表面負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)的正電荷基團(tuán)因靜電吸附而形成牢固結(jié)合；另外，非特異性結(jié)合比較典型的例子是ELISA實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的包被步驟。非特異性結(jié)合無(wú)處不在，ELISA實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到的非特異性反應(yīng)，常常是由于內(nèi)源如風(fēng)濕因子,補(bǔ)體,高濃度非特異性免疫球蛋白,異嗜性抗體等引起的；在不同的pH和離子環(huán)境下，非特異性反應(yīng)情況完全不同，這也是陰離子和陽(yáng)離子純化的基本原理。特異性結(jié)合，指若干具有化學(xué)特性或者生物特性的有機(jī)官能團(tuán)，通過(guò)高度專(zhuān)一而高效的連接方式結(jié)合在一起，并對(duì)外顯示生理活性或理化性質(zhì)。常見(jiàn)的就是我們常用的蛋白純化的標(biāo)簽，6His標(biāo)簽，GST標(biāo)簽，MBP標(biāo)簽，Strep標(biāo)簽等，還有生物素（biotin）與鏈霉親和素(Streptavidin)，凝集素與糖蛋白;其中生物素與鏈霉親和素其解離常數(shù)Kd≈10−14 mol/L，甚至高于抗原-抗體；特異性結(jié)合最大的案例群為抗原與抗體，所有的抗體公司所孜孜不倦苦苦上下求索追求的抗體，無(wú)非就是要找到與抗原特異性結(jié)合的特異性結(jié)合試劑（Specific Binding Reagent），所以這里也就總結(jié)出來(lái)，特異性結(jié)合的特點(diǎn)是專(zhuān)一性，排他性和高效性。
結(jié)合就相當(dāng)于綁在在一起或者磁鐵吸附在一起，結(jié)合力強(qiáng)弱取決于磁力大小，那么偶聯(lián)就是焊接在一起，變成一個(gè)分子；不言而喻，偶聯(lián)的牢固程度和穩(wěn)定性要比結(jié)合強(qiáng)很多，況且結(jié)合的物質(zhì)在溶液中是處于一個(gè)動(dòng)態(tài)的解離和結(jié)合平衡過(guò)程。蛋白質(zhì)偶聯(lián)的共價(jià)偶聯(lián)常用的是氨基（-NH2）與羧基（-COOH），但是-NH2的“人緣”更好一點(diǎn)，現(xiàn)實(shí)中應(yīng)用比較多。關(guān)于蛋白質(zhì)偶聯(lián)和藥物方面的偶聯(lián)相對(duì)比較復(fù)雜，會(huì)用到更復(fù)雜的多步驟程序，這里不做贅述。
抗體的標(biāo)記一般是用于藥物開(kāi)發(fā)和免疫檢測(cè)用途；用于免疫檢測(cè)用途的抗體標(biāo)記從標(biāo)記物上來(lái)說(shuō)，大體上分為酶類(lèi)和熒光素（或熒光蛋白）；酶類(lèi)標(biāo)記物最為常見(jiàn)的是辣根過(guò)氧化物酶（HRP），其次是堿性磷酸酶（AP），其他的如β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。
1.抗體的蛋白酶類(lèi)或熒光蛋白標(biāo)記
酶屬于蛋白質(zhì)，其標(biāo)記到抗體上，利用其與抗體表面暴露的伯氨基（-NH2）進(jìn)行標(biāo)記，最簡(jiǎn)單最粗暴的標(biāo)記方法是用戊二醛進(jìn)行偶聯(lián)，這種標(biāo)記效率低，品質(zhì)控制難度比較大，其中含有大量的酶自聯(lián)或者抗體自聯(lián)，但是對(duì)于簡(jiǎn)單的科研測(cè)試，這個(gè)標(biāo)記手段無(wú)疑是最簡(jiǎn)單快捷的。
除了粗暴的戊二醛標(biāo)記法，當(dāng)然也有通過(guò)交聯(lián)劑間接標(biāo)記的，將兩個(gè)需要偶聯(lián)（標(biāo)記）的蛋白(抗體和標(biāo)記酶)，其中一個(gè)蛋白的-NH2位點(diǎn)上修飾為可與-SH反應(yīng)的集團(tuán)，另一個(gè)蛋白在伯氨基（-NH2）上修飾成-SH，兩個(gè)蛋白修飾后進(jìn)行偶聯(lián)，可以實(shí)現(xiàn)兩個(gè)蛋白的定向偶聯(lián)，如果是抗體和酶進(jìn)行偶聯(lián)的話(huà)，不會(huì)出現(xiàn)抗體自聯(lián)和酶自聯(lián)的情況。這種偶聯(lián)的方法被用于多肽與蛋白載體（如KLH，OVA或BSA）的偶聯(lián)，載體蛋白經(jīng)過(guò)修飾成可以與-SH反應(yīng)的基團(tuán)，如-NHS基團(tuán)，所用的修飾試劑，比如MBS（m-馬來(lái)酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯）,多肽在合成的時(shí)候已經(jīng)在C-端或者N-端預(yù)先合成一個(gè)半胱氨酸（-Cys）接頭，被修飾的蛋白載體與這個(gè)半胱氨酸（-Cys）的-SH順利對(duì)接。說(shuō)到底，這個(gè)方法還是要利用蛋白表面暴露的氨基（-NH2）。我們?cè)趯?shí)踐過(guò)程中經(jīng)常會(huì)被問(wèn)：這個(gè)蛋白中含有10個(gè)賴(lài)氨酸，應(yīng)該可以有10個(gè)-HN2位點(diǎn)被標(biāo)記，其實(shí)這個(gè)是個(gè)誤區(qū)，蛋白經(jīng)過(guò)折疊后可暴露的可用-NH2沒(méi)有這么多。
這里有個(gè)例外，因HRP分子表面含有很多糖基團(tuán)，可以利用氧化的方法使其變成醛基，醛基在酸性的情況下穩(wěn)定的，在遇到抗體的時(shí)候?qū)⒎磻?yīng)條件變換成堿性，醛基與抗體分子的伯氨基，發(fā)生醛胺縮合反應(yīng)：帶醛基的HRP與帶氨基的抗體通過(guò)醛基與伯氨基縮合成希夫堿而進(jìn)行共價(jià)交聯(lián)，這就是經(jīng)典的過(guò)碘酸鈉氧化標(biāo)記法，但是這個(gè)方法對(duì)于普通實(shí)驗(yàn)者來(lái)說(shuō)并不友好，原因主要有以下幾點(diǎn)：1.市面上的HRP太多，五花八門(mén)，怎么去選擇合適的酶，RZ值和活性值（比如，>250U/mg）怎么看？當(dāng)然是選擇RZ高的，活性單位高的，但是這個(gè)價(jià)格也會(huì)高，而往往實(shí)驗(yàn)步驟上體現(xiàn)的又是mg，買(mǎi)到的酶偏偏是IU標(biāo)注，怎么換算？2.過(guò)程控制很重要，抗體標(biāo)記的過(guò)程中HRP氧化的問(wèn)題，養(yǎng)化產(chǎn)物是很不穩(wěn)定，我們做過(guò)測(cè)試氧化超過(guò)30分鐘，HRP很容易沉淀和失活，如果不立即用于抗體標(biāo)記，存放過(guò)程HRP中逐漸聚集或者失活，這樣標(biāo)記效率很低，或者說(shuō)標(biāo)記了很多的失活HRP到抗體上，顯示抗體效價(jià)很低；另外，抗體標(biāo)記過(guò)程中的酶與抗體的量比例的問(wèn)題，如果比例不對(duì)的話(huà)會(huì)造成兩個(gè)極端的結(jié)果：標(biāo)記效率太低或者標(biāo)記后的抗體用于實(shí)驗(yàn)中背景太高。3.標(biāo)記完以后，抗體標(biāo)記物的保存問(wèn)題，這個(gè)是個(gè)很大的問(wèn)題，不正確保存的話(huà)，抗體一周內(nèi)基本就會(huì)失活。所以對(duì)于初學(xué)者，實(shí)驗(yàn)室不是非要建立這個(gè)標(biāo)記的技術(shù)平臺(tái)的話(huà)建議買(mǎi)HRP抗體標(biāo)記試劑盒。
說(shuō)到HRP標(biāo)記試劑盒，我們可能會(huì)認(rèn)為買(mǎi)了試劑盒之后就可以實(shí)現(xiàn)無(wú)憂(yōu)標(biāo)記了，其實(shí)不然，試劑盒只是優(yōu)化了很多條件，使標(biāo)記實(shí)驗(yàn)的風(fēng)險(xiǎn)降到最低。任何實(shí)驗(yàn)都需要在實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真閱讀說(shuō)明書(shū)，對(duì)流程非常熟悉，特別忌諱的是說(shuō)明書(shū)都沒(méi)有認(rèn)真閱讀，拿到試劑盒就看一步做一步，需要提前準(zhǔn)備的材料都沒(méi)有準(zhǔn)備，這樣手忙腳亂的做，操作不能一氣呵成，實(shí)驗(yàn)的最佳時(shí)機(jī)往往錯(cuò)過(guò)了，甚至對(duì)步驟的理解錯(cuò)了，實(shí)驗(yàn)結(jié)果肯定不會(huì)理想。不管是用試劑盒還是自己標(biāo)記，用于標(biāo)記的抗體 一定要符合標(biāo)準(zhǔn)，一定要按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行，抗體純化不好，抗體濃度測(cè)試不準(zhǔn)，抗體溶液環(huán)境不對(duì)，這些都嚴(yán)重影響標(biāo)記效果；簡(jiǎn)單講一下原理，如果抗體濃度不準(zhǔn)，你所計(jì)算的HRP與抗體配比肯定與實(shí)際不符了，標(biāo)記比例不對(duì)；如果抗體純度不夠，雜質(zhì)會(huì)干擾標(biāo)記，很多雜質(zhì)占用了HRP，造成目標(biāo)抗體標(biāo)記不足，這些被標(biāo)記的雜質(zhì)，在后期實(shí)驗(yàn)過(guò)程中又會(huì)產(chǎn)生大量的假信號(hào)。抗體的純化通常就是那么幾種：硫酸銨沉淀，ProteinA/G特異性親和純化，后期一般是通過(guò)透析或者脫鹽置換緩沖液至PBS環(huán)境，教科書(shū)上純化實(shí)驗(yàn)過(guò)程可能不會(huì)強(qiáng)調(diào)透析這個(gè)步驟的重要性，或者只是簡(jiǎn)單告訴你透析幾次，多少時(shí)間換液一次，我們仔細(xì)思考一下這個(gè)問(wèn)題：我們透析液的體積是多少?透析袋里面的液體體積是多少？需要多少小時(shí)透析袋內(nèi)外溶液離子濃度通過(guò)自由擴(kuò)散才能保持一致？假如說(shuō)在磁力攪拌器攪拌的情況下，3小時(shí)透析袋內(nèi)外離子濃度擴(kuò)散到一致，透析袋內(nèi)液體1ml,透析液200ml, ProteinA/G特異性親和純化的過(guò)程，用洗脫液（0.1M Gly-HCl，pH2.7）洗脫和中和緩沖液（0.5M Tris-Cl，pH8.0）中和，此時(shí)抗體溶液的中甘氨酸和Tris濃度很高，-NH2總濃度達(dá)到0.3M左右，我們每次透析稀釋200倍，四次透析后稀釋了1.9*10-4uM,1mg/ml的抗體的濃度為6.67*10-3uM，抗體是-NH2濃度的35倍，這樣的抗體，基本不影響標(biāo)記。但前提是以上的透析必須充分透徹，有時(shí)候我們?yōu)榱耸∈拢褞讉€(gè)抗體放在一個(gè)透析缸里進(jìn)行透析，透析就是不充分了。那么我們?nèi)绾谓鉀Q這個(gè)問(wèn)題呢，在透析的時(shí)候可以試著加一點(diǎn)不會(huì)對(duì)抗體、HRP和標(biāo)記過(guò)程有影響的示蹤劑，這個(gè)示蹤劑的濃度是-NH2總濃度的數(shù)倍，這個(gè)倍數(shù)的確定方法：肉眼可見(jiàn)顏色的示蹤劑最低濃度乘以達(dá)到理想離子去除濃度所應(yīng)該透析的倍數(shù)，最后確定示蹤劑加入的濃度。
蛋白類(lèi)熒光的標(biāo)記，基本上習(xí)慣于利用交聯(lián)劑進(jìn)行間接定向標(biāo)記的技術(shù)路線。最常見(jiàn)的可用于標(biāo)記的熒光蛋白主要有藻紅蛋白（R-PE）和別藻藍(lán)蛋白(APC),還有一個(gè)多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復(fù)合物（PerCP）比較少用。福因德經(jīng)過(guò)數(shù)年測(cè)試，研發(fā)出了藻紅蛋白（R-PE）-抗體標(biāo)記試劑盒和別藻藍(lán)蛋白(APC)-抗體標(biāo)記試劑盒，可以大大節(jié)約科研工作者的標(biāo)記摸索時(shí)間，同時(shí)取得比較好的實(shí)驗(yàn)效果。
2.化學(xué)小分子標(biāo)記物（熒光素標(biāo)記物）的標(biāo)記；
這類(lèi)小分子的標(biāo)記的目標(biāo)基團(tuán)還是蛋白或者抗體表面暴露的-NH2，熒光素經(jīng)過(guò)修飾，其衍生物上含有可以與-NH2反應(yīng)的活性官能團(tuán)，當(dāng)然為了適應(yīng)不同的標(biāo)記反應(yīng)需求，可以在熒光素的修飾不同的官能團(tuán)，以適應(yīng)與抗體不同的官能團(tuán)對(duì)接偶聯(lián)需求。這類(lèi)小分子的標(biāo)記的核心是設(shè)計(jì)出最好的標(biāo)記策略和標(biāo)記條件優(yōu)化，這是兩個(gè)難點(diǎn)，福因德經(jīng)多年的技術(shù)摸索，摸索出最優(yōu)化的標(biāo)記條件，對(duì)于最令人頭疼的摩爾濃度計(jì)算的問(wèn)題，我們開(kāi)發(fā)出在線標(biāo)記計(jì)算小工具，輕松實(shí)現(xiàn)計(jì)算，再也不會(huì)因?yàn)橛?jì)算出錯(cuò)而影響標(biāo)記效果了。目前，我們可以提供的熒光素試劑盒有如下種類(lèi)：Frdbio® 熒光素Cy3, Frdbio® 熒光素Cy5, Frdbio®FITC, Frdbio®熒光素Flour350, Frdbio®熒光素Flour405, Frdbio®熒光素Flour488, Frdbio®熒光素Flour555, Frdbio®熒光素Flour590, Frdbio®熒光素Flour594, Frdbio®熒光素Flour647, Frdbio®熒光素Flour680, Frdbio®熒光素Flour750, Frdbio®熒光素Flour770.
這里要特別說(shuō)說(shuō)關(guān)于生物素（biotin）的標(biāo)記，與上述小分子熒光素的標(biāo)記原理基本相同，生物素標(biāo)記配合鏈霉親和素作為目前應(yīng)用最為廣泛的一種免疫學(xué)檢測(cè)放大手段和工具。福因德研發(fā)團(tuán)隊(duì)在傳統(tǒng)的長(zhǎng)臂生物素標(biāo)記試劑基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出標(biāo)記效率最為友好的生物素結(jié)構(gòu)，主要優(yōu)點(diǎn)：1.標(biāo)記效率提高3-5倍，2.是標(biāo)記產(chǎn)物的穩(wěn)定性更好，3.對(duì)抗體或者被標(biāo)記蛋白結(jié)構(gòu)影響最小。在此技術(shù)支持下的超級(jí)生物素標(biāo)記試劑盒，或許能夠解決您的免疫系統(tǒng)林敏度問(wèn)題。經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的抗體或者蛋白產(chǎn)物，究竟其標(biāo)記效果如何？福因德開(kāi)發(fā)出了相應(yīng)的配套檢測(cè)計(jì)算試劑盒(HABA法生物素標(biāo)記效率檢測(cè)試劑盒)，讓實(shí)驗(yàn)者輕松實(shí)現(xiàn)標(biāo)記效果檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)效果更好，實(shí)驗(yàn)邏輯思路更嚴(yán)謹(jǐn)。生物素與鏈霉親和素是一個(gè)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)經(jīng)典組合，鑒于生物素和鏈霉親和素強(qiáng)大的結(jié)合能力，其可以使免疫學(xué)信號(hào)放大幾十倍甚至上百倍，由于這套系統(tǒng)超高的靈敏度，所以對(duì)于鏈霉親和素酶標(biāo)記復(fù)合物的要求也很高，不但要特異性結(jié)合能力強(qiáng)，而且還要非特異性結(jié)合最少，鏈霉親和素酶復(fù)合物中應(yīng)用最多的是鏈霉親和素-HRP，除此以外還是有各種熒光素結(jié)合復(fù)合物，如FITC-鏈霉親和素，F(xiàn)luor488-鏈霉親和素，等等，需要更多的熒光素標(biāo)記鏈霉親和素，請(qǐng)聯(lián)系我們。
3.酶催化標(biāo)記
酶催化主要是針對(duì)重組蛋白的標(biāo)記的，最為經(jīng)典的是在生物素連接酶(Biotin Ligase,BirA)的催化下，對(duì)含有AviTag標(biāo)簽多肽進(jìn)行特異性標(biāo)記的，AviTag標(biāo)簽多肽是一個(gè)15個(gè)氨基酸的短肽（GLNDIFEAQKIEWHE），標(biāo)記過(guò)程可以在重組蛋白表達(dá)的同時(shí)進(jìn)行，也可以后期在宿主體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，對(duì)重組蛋白進(jìn)行特異性定點(diǎn)標(biāo)記，可以方便蛋白通過(guò)Streptavidin填料進(jìn)行特異性純化，這對(duì)于解決其他標(biāo)簽無(wú)法純化，效果不佳的問(wèn)題，提供新的解決方案和途徑。經(jīng)過(guò)生物素標(biāo)記的蛋白可以更方便用于進(jìn)行下游的免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。關(guān)于通過(guò)生物標(biāo)記途徑進(jìn)行蛋白純化的整體方案，可以與我們技術(shù)部門(mén)溝通，這套體系包括從載體設(shè)計(jì)，到蛋白的生物素標(biāo)記，再到Streptavidin填料純化，以及可能涉及到的蛋白酶切割，我們都可以提供整套解決方案，在此遇到困難的小伙伴可以與我們聯(lián)系解決。
4.特異性結(jié)合與非特異性結(jié)合標(biāo)記
上文已經(jīng)提到了一些，特異性結(jié)合最經(jīng)典應(yīng)用最多的就是生物素-鏈霉親和素（親和素系統(tǒng)），這里有個(gè)經(jīng)典的試劑，SABC試劑，先用生物素標(biāo)記HRP，讓后將生物素標(biāo)記的HRP與鏈霉親和素（親和素）按照特定比例混合，一個(gè)親和素上有4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)，只要生物素的位點(diǎn)不被生物素不被飽和覆蓋（最好是被生物HRP結(jié)合是三個(gè)位點(diǎn)），空余一個(gè)位點(diǎn)，這樣最利于生物化標(biāo)記抗體的下游配套試劑使用，生物素標(biāo)記的抗體的一個(gè)生物素位點(diǎn)可以衍生出三個(gè)HRP分子，信號(hào)瞬間放大3倍以上，比HRP直接標(biāo)記抗體性能好很多倍，當(dāng)然這個(gè)是理想狀態(tài)，實(shí)際實(shí)驗(yàn)中需要實(shí)現(xiàn)高效能需要不斷的優(yōu)化摸索。
非特異性標(biāo)記的經(jīng)典用途是膠體金標(biāo)記，這里不做贅述，需要了解相關(guān)信息，請(qǐng)關(guān)注我們的官方網(wǎng)站，我們將不定期推出非常接地氣的技術(shù)方面的原創(chuàng)文章。