單細胞全基因組測序——求同存異，追本溯源
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細胞是生命體結構和功能的基本單位，人類對生命本源的不斷探索推動了科學技術的發展。單細胞全基因組測序是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術，它對單個細胞異質性的研究不僅在表觀遺傳學、植物學、微生物學等理論研究中發揮重要作用，在癌癥腫瘤疾病診斷治療、胚胎植入前遺傳診斷篩查等臨床應用中也有非常重要的意義。
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2011年，《Nature Methods》將單細胞測序列為年度值得期待的技術之一；2013年，《Science》將單細胞測序列為年度最值得關注的六大領域榜首。近年來單細胞全基因測序不斷發展的技術方法和在各領域的研究成果也屢屢登上“NCS”的榮譽殿堂。仿佛一夜之間，單細胞全基因組檢測技術就成了生物醫藥研究人員的新寵。
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究其原因，除了技術層面的進步，單細胞全基因組測序也體現了科學研究對生命體極大的尊重。下面我們就從幾個方面來解讀這項新興技術。
一、 單細胞全基因組測序技術為什么會興起？
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單細胞全基因組測序的出現并非偶然，而是科學發展到一定階段的必然結果。伴隨著基因測序技術水平的提高以及千人基因組計劃、癌癥基因組計劃、人類腸道宏基因組計劃等重大國際合作項目的相繼開展，基因組研究日益興旺。然而，無論是基因芯片或者二代基因測序技術（NGS）都需要從超過數百萬個細胞中提取DNA或者RNA，得到的信息自然就來自于多個細胞。雖然從宏觀角度有一定的統計學意義，然而從精準生物醫學的角度來看，這種類似于大鍋飯的平均主義的研究方法存在明顯的局限性。此外，對于不易培養的臨床稀有樣品，例如腫瘤循環細胞、早期發育的胚胎細胞等，其量不足以進行基因組的分析，也給基因分析造成了難題。
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單細胞全基因組測序技術的應運而生解決了用組織樣本測序難以解決的細胞異質性難題，為解析單個細胞的行為、機制及其與機體的關系等提供了新方法。這種方法能夠得到單個細胞30億堿基的全基因組序列信息，并且可以對逐個細胞進行序列比較，真正做到求同存異，追本溯源。
二、 單細胞全基因組測序技術都有哪些難點？
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第一，是單細胞的獲取；第二，單細胞基因組的多重擴增；第三，就是高通量測序。
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單細胞的獲取，最初是通過梯度稀釋的方法，既繁瑣也容易污染；隨后通過顯微操作方法，用類似注射器的裝置分離單細胞，或激光捕獲顯微切割技術（LCM），然而可操作性并不強；再往后，流式細胞儀的分揀成為最常用的單細胞分離方法，但對環境要求過高；近年來微流控技術的發明，可以實現單細胞分揀和多重擴增一步完成，逐步成為研究者們的選擇。
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單細胞基因組的多重擴增技術最常用的有：簡并寡核苷酸引物PCR擴增（DOP-PCR）、多重置換擴增反應（MDA）、置換預擴增和PCR擴增的組合（MALBAC）三種技術，各有優缺點。這些擴增方法可以把單細胞中pg級甚至fg級的DNA擴增至可滿足測序的μg級樣品量，正是這些技術的發明才使單細胞基因組測序成為可能。
高通量測序關鍵在于儀器，比如Illumina的HiSeq、Fluidigm的C1，而更多情況下，我們通常選擇高通量測序平臺來進行測序服務，比如華大基因、安諾優達等企業平臺。
三、 各種基因組擴增技術的優缺點是什么？
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針對三種基因擴增技術，市面上已有一些比較成熟的產品，其優缺點主要表現在擴增結果的均一性、覆蓋率、重復性、擴增偏倚性等方面的差別。當然還需根據具體的實驗目的有針對性地選擇產品，成本也是要考慮的一點。
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其中DOP-PCR方法是最為常用和經典的一種擴增法，以Sigma的GenomePlex? Single Cell Whole Genome Amplification Kit（WG4）為例，該技術基于基因組DNA隨機片段化的原理，所得的小片段轉化為兩側含有通用引物位點的PCR擴增文庫分子。WGA通過通用隨機寡核苷酸引物進行的文庫分子PCR擴增實現，在4小時內即可獲得5 - 10 μg 高豐度完整的基因組DNA，最大限度降低等位基因偏倚。（Sigma還有針對二代測序的WGA、WTA的產品）
單細胞全基因組擴增產品優勢分析
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品牌 |
技術方法 |
優勢 | |
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Sigma |
簡并寡核苷酸引物PCR擴增 |
均一性更高、重復性更高、覆蓋度較低，成本低。應用于凝膠電泳、qPCR、CGH微陣列、STR分析、SNP分析等研究。 | |
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The Ampli1? Whole Genome Amplification (WGA) kit |
Silicon Biosystems | ||
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PicoPLEX Single Cell WGA Kit |
NEB | ||
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REPLI-g Single Cell Kit |
Qiagen |
多重置換擴增（MDA） |
基因組覆蓋度高、重復性較低、擴增不均勻、成本低。應用于NGS、CGH微陣列、qPCR分析等，適合做SNP或mutation的研究。 |
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Illustra Single Cell GenomiPhi DNA Amplification Kit |
GE | ||
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TruePrime? Single Cell WGA Kits |
Sygnis | ||
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MALBAC Single Cell WGA Re-Amp Kit |
億康基因 |
置換預擴增和PCR擴增的組合（MALBAC） |
擴增的均一性、覆蓋度高、重復性高、成本高。應用于qPCR、CGH array、SNP array、Sanger測序和高通量測序等。 |
MDA是一種等溫的鏈置換擴增反應，使用隨機的6堿基引物在多位點和模板鏈結合， 接著利用phi29DNA聚合酶的強模板結合與置換能力實現對全基因組的擴增。MALBAC通過形成閉合環來抑制DN**段被重復地復制，以保持DNA擴增的均勻性，解決了傳統方法對單細胞基因組擴增的強烈偏好性的問題。該技術由哈佛大學謝曉亮教授團隊在2012年發明。
四、 單細胞基因組測序目前應用于哪些領域？
自單細胞基因組測序技術興起以來，已有大量成果發表在“NCS”等國際著名學術期刊上，該技術不僅被應用在單細胞基因組學研究、細胞異質性研究、微生物單細胞測序、植物學研究等理論研究中，還在基于循環腫瘤細胞（CTC）的癌癥無創診斷研究和基于胚胎植入前篩查診斷的（PGS、PGD）的輔助生殖研究中發揮重要作用。當然肯定還有許多研究方向和成果是我們未知的，下圖例舉了該技術在各領域取得的部分重要研究成果。
自單細胞基因組測序技術興起以來，已有大量成果發表在“NCS”等國際著名學術期刊上，該技術不僅被應用在單細胞基因組學研究、細胞異質性研究、微生物單細胞測序、植物學研究等理論研究中，還在基于循環腫瘤細胞（CTC）的癌癥無創診斷研究和基于胚胎植入前篩查診斷的（PGS、PGD）的輔助生殖研究中發揮重要作用。當然肯定還有許多研究方向和成果是我們未知的，下圖例舉了該技術在各領域取得的部分重要研究成果。
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五、 單細胞基因組測序技術未來的發展如何？
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單細胞全基因測序技術目前還處于初級階段，在技術上仍有許多難點丞待解決，例如：如何高效地分離單細胞，如何確保全基因組完整、均一、無偏差的擴增，以及如何保證基因組測序及數據分析的準確性等。近年來各大生物醫藥巨頭都將戰略聚焦在該技術上，2016年初Illumina攜手Bio-Rad進軍單細胞測序，研發新的單細胞測序流程；CAR-T治療巨頭Juno收購AbVitro（單個T細胞和B細胞進行基因測序），意圖在癌癥免疫療法中再創輝煌；10X Genomics推出單細胞測序新設備，已開始接受預定。這些重磅消息無疑表明單細胞基因組測序將引領新一代測序技術的潮流。
回到本文的開頭，細胞是生命體結構和功能的基本單位，只有真正認識了解每一個細胞，才能在理論研究中做到真實客觀，才能在臨床疾病診斷和治療時準確無誤。未來，日益更新的測序技術和不斷拓寬的研究方向會帶領我們從單細胞層面更加精準的理解生命體，進而發現生命的真諦。
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