問題1.為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？
?
答：可以從這幾個方面去查找原因：
（1）免疫的抗原，分子量和抗原性是否合適；分子量最好不小于25kDa;對于小分子化合物或者多肽，需要偶聯載體蛋白，比如KLH,OVA或者KLH，一般首選KLH;
?
(2)免疫的佐劑是否合適，免疫的佐劑常用的是弗氏完全佐劑與不完全佐劑，可以試試其他的佐劑，比如水溶性佐劑；
?
（3）免疫程序是否合適，不同佐劑需要設計不同的免疫程序，一般免疫三次后，效價依然沒有起色的話，就需要重新考慮目前的抗原設計、抗原和免疫程序問題；
?
（4）免疫計量問題，蛋白類抗原，免疫之前，通過SDS-PAGE確定蛋白量的問題，比其他蛋白濃度測定方法更靠譜；每種蛋白濃度測定方法都有其缺陷；
?
（5）免疫方式問題，免疫的時候盡可能多點，多部位，必要的時候可以配合脾臟免疫和尾靜脈免疫；
?
（6）效價測定的問題，測免疫效價，一般采用間接ELISA法，這個方法需要搭建好ELISA測定程序，比如抗原包被的最佳濃度選擇，二抗使用濃度，底物靈敏度；另外，對于不同濃度的抗原，對其效價的評價需要區別對待：對于抗原性比較較弱的，1:10000以上就是非常好的選擇，對于小分子效價，1:3000也算成功。
?
問題2:融合后細胞不長或者融合后克隆很少？
?最重要的制約因素：血清，融合劑PEG，SP2/0狀態，小鼠種系
（1）培養基和血清問題，特別是血清，市面上的血清良莠不齊，不管是什么牌子的，需要親自做融合測試篩選，篩選到最適合融合培養的，這個工作量有點大，很多人不愿意去做；
?
（2）融合試劑PEG問題，這個其實是很簡單的問題，可以買大牌成品的融合劑，比如Sigma P7181,也可以買大品牌的干粉自己配制，這需要實驗室的實驗用水比較過關；
?
（3）免疫所用的Balb/C小鼠，品系是否純正，如果品系不純正，即使融合成功，后期在亞克隆過程中，細胞株養不活后者分泌抗體能力越來越弱。
?
（4）HAT和HT濃度要合適，如果對于HT好HAT試劑組分濃度計算不是特別熟悉或者來源不是特別的純正的，最好購買商業化的配制好的；自己配制的話要做細胞培養濃度測試，這個實驗步驟繁瑣。
?
（5）飼養細胞問題，傳統教科書上融合后鋪板需要加入飼養細胞，其實如果血清出色，并不需要添加飼養細胞，添加飼養細胞，無形中還增加了污染的可能；我可能用融合專用血清，15%-20%濃度，一個老鼠脾臟細胞與一個T75細胞培養瓶的SP2/0融合，鋪板12-15塊，根本不用加入飼養細胞，當然這也需要看免疫的脾臟的大小，不同的老鼠和不同免疫抗原免疫出來的脾臟的大小差異還是很大。飼養細胞的作用，是臨時提供細胞因子和伴侶支持；
?
（6）鋪板的密度問題，建議每個96孔的板孔鋪總細胞數量在100000個左右為宜。
?
（7）細胞可能被污染。細菌污染很容易觀察，培養基很快會變渾濁，培養基變得很黃，真菌污染也很容易判斷，支原體污染不容易辨別和發現，可以通過試劑盒檢測。
?
（8）已經問題：培養箱溫度，濕度和CO2濃度是否合適；如果不合適，細胞可能不能很好生長；特別是大實驗室，培養細胞的人很多共用一個培養箱，反復開關，CO2濃度、溫度和濕度都很難保證穩定。
?
3.? 融合后檢測不到陽性克隆？
?
（1）??????檢測方案是否正確，有沒有做平行的陽性對照；
（2）??????檢測系統與培養液里面的成分干擾了；
（3）??????融合的集落太小，分泌的抗體太少；
（4）??????長起來的集落是假融合（HAT失活）細胞，或者不正常的集落；
?
4.? 融合后檢測是滿板的陽性？
（1）建立有效的檢測方法，上文已經提及，檢測時同時設置平行的陰陽性對照孔；
（2）培養基富營養化，未融合的細胞存活時間太長，分泌大量陽性抗體在孔里；解決方案：置換培養液之后再次檢測；
（3）每個細胞板孔細胞集落太多，解決方案：稀釋轉板培養之后，等生長起來再次檢測；
?
5.融合后的細胞生長很慢？
（1）培養液，特別是血清不太適合細胞生長；一定要選用優質適合雜交瘤生長的血清；
（2）培養耗材對細胞生長不太友好；
（3）細胞量比較少的時候，比如亞克的時候，可以適當添加飼養細胞或者雜交瘤克隆生長因子；
（4）細胞存在污染，比如支原體污染，有的甚至導致細胞死亡；
（5）確實有個別細胞對于營養的需求比較特殊，不容易生長或者生長緩慢，但是分泌抗體能力很強，一個孔里有幾個細胞就檢測到超強的信號。
?
?
6.? 經過幾輪亞克，陽性的克隆變成陰性？
?
（1）細胞株不純，不分泌的細胞占據優勢，亞克隆的過程中，陽性細胞沒有分種到細胞孔里，或者及時分種到了，克隆沒有長起來，自然沒有篩選到陽性克?。?/p>
（2）細胞株不穩定，容易發生染色體丟失；所以再細胞傳代的過程中需要經常做一下亞克隆；
（3）細胞生長的環境不友好，比如，把細胞培養老了，半死不活的再救回來，可能很多細胞已經變性了；
（4）細胞被污染了，也很容易不再分泌抗體，最典型的就是支原體污染；
?
7. 為什么亞克隆長不出克隆？
（1）培養基不給力，加點雜交瘤細胞生長因子加入適量的飼養細胞（每孔100000個）
（2）用于亞克隆的母細胞狀態不好；
（3)亞克隆時，細胞計數不準或者計算錯誤；
（4）細胞被污染了，最典型的就是支原體污染；
（5）使用HAT培養的細胞，在亞克隆時候培養液里要添加HT，原因是上一步驟HAT中的A殘留，如果不添加HT，會使細胞致死；
（6）其他的硬件問題，與上面的內容相同。
?
8. 雜交瘤注射到小鼠腹腔不產腹水，只長實體瘤或者產生的腹水沒有效價？
（1）小鼠種系不純，容易不產腹水或者產生的腹水沒有效價
（2）致敏劑不太好，或者使用量不夠，每只老鼠可以打0.6-0.8ml,隔一周再打一次，兩次致敏以后，再注射雜交瘤細胞；
（3）注射腹腔內的細胞量不夠，每次每只老鼠注射10^5-10^6個細胞，用滅菌的PBS或者不完全培養基懸浮，體積0.5-1ml
(4)產生過多實體瘤的原因，可能是在主色的時候，刺傷了腹腔皮下或肌肉或者腸道，沒有將細胞充分注射到腹腔內；手法很重要；
（5）雜交瘤所產生的抗體與小鼠體內的某個分子特異性結合，產生的抗體被中和，這類抗體針對的靶蛋白與小鼠自身的蛋白物質序列高度同源。
?
?
9.? 雜交瘤細胞凍存復蘇不活？
（1）培養液的配方和關鍵試劑血清和DMSO，DMSO一定要選擇適合細胞培養級別的；配方含有10% DMSO，凍存液至少含有10%-50%的血清；
（2）細胞本身的原因，讓細胞處于最佳狀態，對數生長時期，細胞數量10^6/ml的濃度比較合適；
（3）凍存的過程中，梯度降溫很重要；最簡單的方法，將細胞凍存管裹在厚厚的棉花里，埋在干冰里，或者塞在液氮罐的氣相過夜，第二天放到液氮里，我們用這個方法從來沒有失手。
（4）解凍的過程中，調一大燒杯的熱水，熱水的穩定稍微高一點，41℃-42℃，不停的攪動，直到完全解凍，吸取凍存的細胞，轉入到15ml離心管，再補滿不完全培養基，混勻，離心，棄掉上清。細胞沉淀用完全培養基重選培養。
（5）細胞凍存的液氮罐，定期維護，補加液氮，不要液面太低或者液氮揮發完了、
?
10.細胞污染的挽救
細胞的污染大致可以分三類：細菌污染、真菌污染和支原體污染，還可能由不明微生物污染。
（1）細菌污染，可以加大抗生素濃度，將細胞稀釋培養，抗生素濃度加到原來10倍，每隔12小時換液，反復幾次；
（2）真菌污染的話，從兩種抗生素加到三種抗生素比如，我們常用的抗生素是鏈霉素和青霉素，可以再加一個兩性霉素B,或者制霉菌素；將細胞稀釋培養，多次換液，堅持培養一周。
（3）支原體污染，如果輕度污染，可以試試使用60 ug/ml的泰樂菌素和10 ug/ml左右的環丙沙星交替處理；我們還新研發的支原體處理試劑，效果比較好，也是稀釋培養，多次換液，堅持培養一周。
（4）利用動物免疫系統清除，將污染的細胞注射到小鼠背部或者腹腔，等實體瘤快長成的時候，再無菌超凈臺上取下實體瘤，再次培養。
?
關于單克隆抗體制備可能出現的問題，我們還會繼續收集問題，也歡迎大家提出實際工作中更多的問題，我們一起探討學習和提高。
文中提到的解決方案，我們都有成熟的配套產品，歡迎咨詢。
?