? ? ? ? 多發性硬化癥是一種中樞神經系統的慢性炎癥性疾病，也是以中樞神經系統白質炎性脫髓鞘病變為主要特點的自身免疫病。多發性硬化癥的病因學涉及多基因風險變異和環境觸發因素之間的復雜相互作用。因此，研究遺傳易感性和環境誘因如何塑造個體免疫細胞的相互作用，對于理解包括多發性硬化癥在內的自身免疫性疾病的病理生理學至關重要。? ? ? ? 2022年2月16日，蘇黎世大學和慕尼黑大學的研究人員在Nature雜志在線發表了題為Twin study reveals non-heritable immune perturbations in multiple sclerosis的文章[1]。作者對61對同卵雙胞胎進行了深入分析，有趣的是，同卵雙胞胎中，一人患有多發性硬化癥，而另一人未患有多發性硬化癥。同卵雙胞胎們攜帶相同的遺傳物質和所處的早期生活環境相同，從而消除了大部分可變遺傳以及早期環境對異質人群的影響。作者利用Fluidigm質譜流式技術（CyTOF）和CITE-seq等多組學技術并結合機器學習算法全面而深入分析雙胞胎的免疫系統，并解釋為什么兩個人具有相同的遺傳易感性和受到相同早期環境影響，卻能表現出不同的多發性硬化癥臨床表型(圖1a)。? ? ? ? 作者利用質譜流式技術，設計了2個panel，分別由37個marker組成，其中一個panel由表面蛋白和轉錄因子組成，對免疫細胞的表型，轉運和激活狀態進行分析，另外一個panel由表面蛋白和13個細胞因子組成，對不同類型免疫細胞的細胞因子和轉運蛋白的表達情況進行分析。選取多發性硬化癥患者和他們未受影響同胞的PBMCs樣本進行檢測，全面分析免疫細胞亞群的變化。為了降低樣本間的實驗誤差，作者使用了Live Barcode技術，用帶有不同金屬標簽的CD45抗體對樣本標記，將幾十個樣本混在一起進行panel抗體染色和數據采集，不僅提高了檢測通量，而且使數據更加精準，挖掘出低豐度蛋白的變化。采集的數據通過FlowSOM聚類和手動合并簇構建典型免疫細胞群的參考框架，另外結合貝葉斯算法的diffcyt工具，共鑒定了1400個免疫特征，每個特征代表了給定免疫簇中一個細胞狀態標記的表達。從中尋找差異性免疫特征，差異特征需要滿足兩個條件：1）在所有雙胞胎中能夠區分多發性硬化癥的患者和其健康同胞；2）不是由疾病修飾治療誘發的(圖1b)。共鑒定18個差異特征即差異狀態節點，其中12個位于TH細胞區域，1個接近非傳統的T細胞參考節點，3個接近自然殺傷(NK)細胞參考節點和其余2個位于髓系細胞區域(圖1b)。其中，TH細胞和髓系細胞群體改變最為顯著。
圖1. 多發性硬化癥臨床表型不一致的雙胞胎中循環TH細胞和髓系細胞表現出顯著差異。a, CyTOF和CITE-seq來揭示環境觸發的多發性硬化癥免疫改變。b, Diffcyt自動分析并篩選出所有雙胞胎和未接受多發性硬化癥治療的雙胞胎之間不同的免疫特征(左)。網絡可視化無監督聚類FlowSOM的免疫細胞群參考框架(米色：自動聚類節點，紅色：差異狀態節點) (右)。
質譜流式技術助力研究發現患有多發性硬化癥雙胞胎的免疫系統特征變化，即環境觸發的多發性硬化癥免疫改變：
髓系細胞——單核細胞的CCR2-CSF2R升高
? ?多發性硬化癥相關的單核細胞特征在差異狀態節點中發現，單核細胞趨化受體2(CCR2) 和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)受體特異性亞基(CD116)蛋白在患有多發性硬化癥的雙胞胎中表達水平更高（圖2a)。這種差異狀態吞噬細胞節點的表型類似于經典單核細胞(圖2a)。然而，CD14表達低，CD16不表達，阻礙了其歸類為典型免疫亞群。CCR2和CD116在未治療的雙胞胎中表達尤其明顯，表明這種特殊多發性硬化癥相關的變化易受疾病修飾治療的影響(圖2a)，且對炎癥刺激敏感。
圖2.患有多發性硬化癥的雙胞胎的髓系細胞向單核細胞群轉移，CCR2和GM-CSF受體的表達增加。
淋巴細胞——TH細胞的CD25增加
? ? ? ? 淋巴細胞是多發性硬化癥雙胞胎和未受影響雙胞胎之間最顯著的變化(圖1b)。在固有淋巴細胞中，患有多發性硬化癥雙胞胎的NK細胞中CCR6表達增加，CXCR3和CD25的表達減少；NKT細胞節點中CCR6的表達降低(圖3a)。CD4+效應記憶T細胞(TEMRA)節點中CXCR3表達顯著降低，而CD69表達顯著升高 (圖3b)。? ? ? ? 在雙胞胎隊列中，最主要的變化在TH細胞節點。8個簇是以明顯地高表達CD25 (IL-2受體高親和鏈) 為特征的初始TH細胞，其中一個節點CCR4表達增加，一個節點CD127表達減少(圖3b)。初始TH細胞亞群中CD25高表達代表了多發性硬化癥雙胞胎循環免疫細胞中最普遍的免疫改變。轉錄組和偽時間分析進一步表明，該群體處于移行差異狀態，初始標記(CD45RA和CCR7)下調和記憶相關蛋白質(CD45RO和CD25)上調。
圖3.?患有多發性硬化癥雙胞胎的淋巴細胞變化。a, 固有淋巴細胞變化；b,TH細胞變化：高表達CD25。
細胞因子——初始TH細胞的IL-2增加
? ? ? ? 接下來作者研究了多發性硬化癥雙胞胎移行TH差異狀態節點中CD25表達增加的功能意義。使用PMA(PKC激活劑)和離子霉素對臨床表型不一致的同卵雙胞胎的PBMCs進行刺激，利用含有12細胞因子標記物的panel，分析細胞因子和轉運相關標記物變化情況(圖3a)。TH細胞節點表現出初始表型，其特征是CD25及其配體IL-2表達增加(圖3b)。通過擴展殘疾狀態量表(EDSS)評估雙胞胎患者多發性硬化癥的嚴重程度，發現移行TH細胞節點中IL-2表達差異與多發性硬化癥的嚴重程度存在很強的正相關，且與處于復發緩解期多發性硬化癥(RRMS)的雙胞胎相比，繼發性進行性多發性硬化癥(SPMS)的雙胞胎IL-2表達顯著升高(圖3c)。
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圖4.?患有多發性硬化癥雙胞胎的細胞因子變化。a, PBMCs以抗原非依賴的方式被激活，發現CD25高表達TH細胞節點，并分析其細胞因子和轉運特征變化；b, 差異狀態節點細胞中CD25和IL-2的表達水平；c, IL-2表達與多發性硬化癥雙胞胎擴展殘疾狀態量表(EDSS)的相關性。
? ? ? ? 這項研究作者巧妙地設計實驗值得借鑒：1）選取多發性硬化癥臨床表型不一致的同卵雙胞胎，排除遺傳和早期環境因素的影響，從而發現環境因素影響的免疫特征；2）利用質譜流式技術在單細胞水平收集59個參數信息，全面深入分析免疫細胞表型和功能；3）采用Live Barcode技術，同時染色和采集配對雙胞胎樣本數據，降低樣本間的實驗偏差，從而發現初始TH細胞中整體表達相對較低的CD25，在臨床表型不同的雙胞胎間的差異，此特征為多發性硬化癥最顯著變化；4）獨特的人工智能算法，識別出1400個免疫特征，并發現18個差異特征，揭示獨特環境影響驅動的特異性免疫效應。? ? ? ? Fluidigm公司研發的質譜流式技術是一種高通量單細胞蛋白質分析技術，利用金屬元素作為抗體的標簽，以質譜作為檢測手段，可同時分析單細胞表面和內部的50多種標志物，由于采用特殊的金屬元素作為檢測信號，背景信號極低，徹底解決傳統流式的熒光串色的問題，并在多領域得到廣泛應用。
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參考文獻：
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