水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物，其生長發育過程受到多種基因及其調控機制的復雜影響。其中，PPR蛋白（Pentatricopeptide Repeat Protein）是一類廣泛存在于植物中的關鍵蛋白質家族，主要負責調控線粒體和葉綠體中的RNA代謝，參與植物光合作用、呼吸作用、花粉育性及胚乳發育等重要生物過程。OsCPPR1是水稻中一個細胞質定位的PPR蛋白，含有16個PPR基序，能夠特異性結合并降解GOLDEN2-LIKE1 (OsGLK1)轉錄本，從而影響水稻花粉的正常發育。然而，OsCPPR1如何識別并結合OsGLK1 mRNA，以及以何種方式調控其表達水平，仍是未解之謎。莊楚雄研究員團隊在其研究中揭示了水稻中定位于細胞質的PPR蛋白OsCPPR1在花粉發育中的功能，但OsCPPR1如何行使對RNA識別和結合所起的作用并未得到闡明。為此，華南農業大學近期發表的研究通過解析OsCPPR1蛋白的結構，揭示了其RNA識別與結合機制，為理解植物生長發育中的分子調控提供了新思路。水稻OsCPPR1蛋白RNA識別及結合特性分析，對于理解水稻的基因表達調控機制，乃至提高水稻的產量和抗逆性，具有重要的科學意義和實際應用價值。

圖1

技術手段：

分子對接、圓二色譜（百泰派克提供技術支持）、RNA-EMSA

研究結果：

1、OsCPPR1的保守氨基酸和結構特征

在完整的PPR重復序列中，位于第5位的氨基酸殘基負責序列對單鏈RNA堿基的特異性識別。為了分析每個PPR重復序列的殘基是否對其結合活性或靶RNA識別至關重要，文章將每個PPR基序中第5位的氨基酸突變為丙氨酸（圖2A），命名為OsCPPR1m；另外重組出兩個OsCPPR1的截斷版本(OsCPPR1(aa 135-end)/OsCPPR1(aa1 - 666))來探究不同的PPR基序是否會影響OcCPPR1與靶RNA的結合活性。研究結果表明，OsCPPR1的c端PPR重復基序比n端PPR基序更保守（圖2B）；對這些OsCPPR1蛋白結構的預測表明，兩種截斷的OsCPPR1變異導致α 螺旋數和螺旋間角度發生不同變化；使用ProteinTools，可以觀察到OsCPPR1m中比OsCPPR1中有更多的疏水簇和鹽橋。

圖2. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白的結構和相似性分析

文章用圓二色譜（CD）分析了OsCPPR1和截斷OsCPPR1的蛋白二級結構，結果表明每個PPR中第5個氨基酸的突變對OsCPPR1的二級結構有影響（圖3）。這些數據表明，每個PPR中第5個氨基酸的突變可能導致蛋白功能活性的喪失。

圖3. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白圓二譜圖

2、不同的OsCPPR1蛋白表現出不同的RNA相互作用活性

為了確定PPR重復基序與不同的OsCPPR1和靶RNA的結合活性之間是否存在關系，文章利用OsGLK1 G4-RNA（先前的靶結合RNA片段）通過大分子對接實驗預測了完整的OsCPPR1、兩個截斷的OsCPPR1變體和OsCPPR1m的RNA結合活性。預測結果表明每個PPR基序（OsCPPR1m）的突變能顯著影響RNA結合，并且結合能力是這些蛋白中最弱的（圖4）；OsCPPR1、OsCPPR1（aa 135-end）和OsCPPR1（aa 1-666）不同程度地與RNA結合，但相互作用位點并不一致（圖4）。文章使用OsGLK1 G4探針進行了RNA-電泳遷移轉移實驗（EMSA），發現缺乏N-端PPR基序的OsCPPR1比缺乏C-端PPR基序的OsCPPR1表現出更強的相互作用活性（圖5）。這些結果表明，OsCPPR1結構的改變改變了酶的活性，OsCPPR1的C-端PPR基序在結合活性中起重要作用。

圖4. 不同的OsCPPR1蛋白與RNA的相互作用

圖5. RNA-EMSA實驗

3、5′-RNA連接酶介導的cDNA末端快速擴增（RLM-5′RACE）鑒定OsGLK1 RNA裂解位點

文章在野生型和OsCPPR1過表達植株中進行了RLM-5′RACE實驗，在OsCPPR1過表達植物和野生型中檢測到類似的OsGLK1 mRNA切割模式位點。與前期研究一致，這些位點的分布不集中在OsGLK1 mRNA任何區域，且分布位置分散。這一結果表明，OsCPPR1可能只優先與靶RNA結合，但對靶RNA的切割活性可能需要其他輔助因子，需要在未來的研究中進一步探索。

圖6. 在野生型（WT）和OsCPPR1過表達（CPPR1-OE）植株中，5′-RNA連接酶介導的cDNA末端產物快速擴增的位置

研究結論：

本研究通過結構分析和靶RNA序列識別的大分子對接實驗揭示了水稻OsCPPR1蛋白RNA識別及結合特性分析過程中OsCPPR1蛋白的結構基礎和功能特性，深入解析了其在水稻基因表達調控中的重要作用，證明了OsCPPR1的識別和結合活性依賴于一套完整的PPR基序。每個PPR基序中的第5個氨基酸可能通過為靶RNA識別提供獨特的接口并在OsCPPR1中發揮保守作用；不同的OsCPPR1截斷版本強調了所有PPR基序在RNA-EMSA中發揮的關鍵作用。這些結果共同表明，OsCPPR1直接結合OsGLK1 mRNA，可能與完整的PPR基序相關。這不僅加深了我們對PPR蛋白家族的理解，也為未來通過分子育種手段優化水稻基因表達調控網絡提供了新的科學依據。

百泰派克生物科技致力于為科研人員提供全面的蛋白質組學和多組學技術支持，擁有豐富的技術經驗和高效的實驗平臺。在華南農業大學針對水稻OsCPPR1蛋白RNA識別及結合特性分析的研究中，百泰派克通過圓二色譜等先進技術手段，為OsCPPR1蛋白的結構解析提供了強有力的支持。未來，百泰派克將繼續為廣大科研伙伴提供高質量的技術服務，助力更多重要科學發現的實現。

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