水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物，其生長發(fā)育過程受到多種基因及其調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜影響。其中，PPR蛋白（Pentatricopeptide Repeat Protein）是一類廣泛存在于植物中的關(guān)鍵蛋白質(zhì)家族，主要負(fù)責(zé)調(diào)控線粒體和葉綠體中的RNA代謝，參與植物光合作用、呼吸作用、花粉育性及胚乳發(fā)育等重要生物過程。OsCPPR1是水稻中一個(gè)細(xì)胞質(zhì)定位的PPR蛋白，含有16個(gè)PPR基序，能夠特異性結(jié)合并降解GOLDEN2-LIKE1 (OsGLK1)轉(zhuǎn)錄本，從而影響水稻花粉的正常發(fā)育。然而，OsCPPR1如何識(shí)別并結(jié)合OsGLK1 mRNA，以及以何種方式調(diào)控其表達(dá)水平，仍是未解之謎。莊楚雄研究員團(tuán)隊(duì)在其研究中揭示了水稻中定位于細(xì)胞質(zhì)的PPR蛋白OsCPPR1在花粉發(fā)育中的功能，但OsCPPR1如何行使對RNA識(shí)別和結(jié)合所起的作用并未得到闡明。為此，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)近期發(fā)表的研究通過解析OsCPPR1蛋白的結(jié)構(gòu)，揭示了其RNA識(shí)別與結(jié)合機(jī)制，為理解植物生長發(fā)育中的分子調(diào)控提供了新思路。水稻OsCPPR1蛋白R(shí)NA識(shí)別及結(jié)合特性分析，對于理解水稻的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，乃至提高水稻的產(chǎn)量和抗逆性，具有重要的科學(xué)意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
圖1
技術(shù)手段：
分子對接、圓二色譜（百泰派克提供技術(shù)支持）、RNA-EMSA
研究結(jié)果：
1、OsCPPR1的保守氨基酸和結(jié)構(gòu)特征
在完整的PPR重復(fù)序列中，位于第5位的氨基酸殘基負(fù)責(zé)序列對單鏈RNA堿基的特異性識(shí)別。為了分析每個(gè)PPR重復(fù)序列的殘基是否對其結(jié)合活性或靶RNA識(shí)別至關(guān)重要，文章將每個(gè)PPR基序中第5位的氨基酸突變?yōu)楸彼幔▓D2A），命名為OsCPPR1m；另外重組出兩個(gè)OsCPPR1的截?cái)喟姹?OsCPPR1(aa 135-end)/OsCPPR1(aa1 - 666))來探究不同的PPR基序是否會(huì)影響OcCPPR1與靶RNA的結(jié)合活性。研究結(jié)果表明，OsCPPR1的c端PPR重復(fù)基序比n端PPR基序更保守（圖2B）；對這些OsCPPR1蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測表明，兩種截?cái)嗟腛sCPPR1變異導(dǎo)致α 螺旋數(shù)和螺旋間角度發(fā)生不同變化；使用ProteinTools，可以觀察到OsCPPR1m中比OsCPPR1中有更多的疏水簇和鹽橋。
圖2. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白的結(jié)構(gòu)和相似性分析
文章用圓二色譜（CD）分析了OsCPPR1和截?cái)郞sCPPR1的蛋白二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明每個(gè)PPR中第5個(gè)氨基酸的突變對OsCPPR1的二級結(jié)構(gòu)有影響（圖3）。這些數(shù)據(jù)表明，每個(gè)PPR中第5個(gè)氨基酸的突變可能導(dǎo)致蛋白功能活性的喪失。
圖3. OsCPPR1、OsCPPR1（aa135-end）和OsCPPR1（aa1-666）蛋白圓二譜圖
2、不同的OsCPPR1蛋白表現(xiàn)出不同的RNA相互作用活性
為了確定PPR重復(fù)基序與不同的OsCPPR1和靶RNA的結(jié)合活性之間是否存在關(guān)系，文章利用OsGLK1 G4-RNA（先前的靶結(jié)合RNA片段）通過大分子對接實(shí)驗(yàn)預(yù)測了完整的OsCPPR1、兩個(gè)截?cái)嗟腛sCPPR1變體和OsCPPR1m的RNA結(jié)合活性。預(yù)測結(jié)果表明每個(gè)PPR基序（OsCPPR1m）的突變能顯著影響RNA結(jié)合，并且結(jié)合能力是這些蛋白中最弱的（圖4）；OsCPPR1、OsCPPR1（aa 135-end）和OsCPPR1（aa 1-666）不同程度地與RNA結(jié)合，但相互作用位點(diǎn)并不一致（圖4）。文章使用OsGLK1 G4探針進(jìn)行了RNA-電泳遷移轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)（EMSA），發(fā)現(xiàn)缺乏N-端PPR基序的OsCPPR1比缺乏C-端PPR基序的OsCPPR1表現(xiàn)出更強(qiáng)的相互作用活性（圖5）。這些結(jié)果表明，OsCPPR1結(jié)構(gòu)的改變改變了酶的活性，OsCPPR1的C-端PPR基序在結(jié)合活性中起重要作用。
圖4. 不同的OsCPPR1蛋白與RNA的相互作用
圖5. RNA-EMSA實(shí)驗(yàn)
3、5′-RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端快速擴(kuò)增（RLM-5′RACE）鑒定OsGLK1 RNA裂解位點(diǎn)
文章在野生型和OsCPPR1過表達(dá)植株中進(jìn)行了RLM-5′RACE實(shí)驗(yàn)，在OsCPPR1過表達(dá)植物和野生型中檢測到類似的OsGLK1 mRNA切割模式位點(diǎn)。與前期研究一致，這些位點(diǎn)的分布不集中在OsGLK1 mRNA任何區(qū)域，且分布位置分散。這一結(jié)果表明，OsCPPR1可能只優(yōu)先與靶RNA結(jié)合，但對靶RNA的切割活性可能需要其他輔助因子，需要在未來的研究中進(jìn)一步探索。
圖6. 在野生型（WT）和OsCPPR1過表達(dá)（CPPR1-OE）植株中，5′-RNA連接酶介導(dǎo)的cDNA末端產(chǎn)物快速擴(kuò)增的位置
研究結(jié)論：
本研究通過結(jié)構(gòu)分析和靶RNA序列識(shí)別的大分子對接實(shí)驗(yàn)揭示了水稻OsCPPR1蛋白R(shí)NA識(shí)別及結(jié)合特性分析過程中OsCPPR1蛋白的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)和功能特性，深入解析了其在水稻基因表達(dá)調(diào)控中的重要作用，證明了OsCPPR1的識(shí)別和結(jié)合活性依賴于一套完整的PPR基序。每個(gè)PPR基序中的第5個(gè)氨基酸可能通過為靶RNA識(shí)別提供獨(dú)特的接口并在OsCPPR1中發(fā)揮保守作用；不同的OsCPPR1截?cái)喟姹緩?qiáng)調(diào)了所有PPR基序在RNA-EMSA中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。這些結(jié)果共同表明，OsCPPR1直接結(jié)合OsGLK1 mRNA，可能與完整的PPR基序相關(guān)。這不僅加深了我們對PPR蛋白家族的理解，也為未來通過分子育種手段優(yōu)化水稻基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的科學(xué)依據(jù)。
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