Edman降解法耦合過(guò)程
異硫*酸苯酯（PITC）在多肽鏈的N端與a-氨基（或在脯氨酰殘基帶有亞氨基的情況下）進(jìn)行反應(yīng)，形成末端殘基的苯硫代氨基甲酰基衍生物。Edman降解法最初使用吡啶來(lái)生成pH值為8.6的堿性環(huán)境，后來(lái)用的的替代品包括“Quadrol”、三甲胺和N-甲基**。然而Edman降解法需要游離的α-氨基，如果氨基已經(jīng)被修飾將不能與PITC反應(yīng)，那么該多肽就相當(dāng)于是“封閉的”（例如，許多蛋白質(zhì)就被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰基團(tuán)封閉）。例如，微量的非離子型洗滌劑即會(huì)引起末端封閉。另外，肽本身可能根本不具有N端：如環(huán)狀天然肽，環(huán)孢菌素。在沒(méi)有游離N端的情況下，必須通過(guò)化學(xué)或酶促方法切割多肽以產(chǎn)生具有游離N端的片段。需要注意避免樣品被含胺的非肽類物質(zhì)（如trizma堿）污染，因?yàn)檫@些物質(zhì)也可能與PITC反應(yīng)并生成干擾后續(xù)分析的產(chǎn)物。PITC還會(huì)與水和一些難以在反應(yīng)中被完全排除的其他分子發(fā)生反應(yīng)，因此試驗(yàn)中總會(huì)發(fā)現(xiàn)一些副產(chǎn)物，例如二苯硫脲。盡量減少副反應(yīng)有助于提高化學(xué)反應(yīng)和后續(xù)分析的效率。與過(guò)去的手動(dòng)測(cè)序法相比，自動(dòng)測(cè)序法的優(yōu)勢(shì)之一就是可以做到這一點(diǎn)。
Edman降解法裂解過(guò)程
在強(qiáng)酸存在的情況下，裂解發(fā)生在第一個(gè)肽鍵上，從而得到減去第一個(gè)堿基的肽段和釋放的第一個(gè)anilinothiazolinone (ATZ)形式的殘基。洗掉其他反應(yīng)物和釋出的殘基，縮短的肽段就可以通過(guò)另一輪偶聯(lián)和裂解而釋放出第二個(gè)殘基，依此類推，直到最后一個(gè)氨基酸殘基被釋出。
目前，該裂解反應(yīng)使用的是三氟乙酸（TFA）。因?yàn)橐苟嚯逆渻?nèi)各點(diǎn)的酸水解最小化，需要盡可能的制造無(wú)水環(huán)境。這些都達(dá)成之后，可生成一個(gè)新的N端，從而對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。將這種酸裂解最小化可促使序列運(yùn)行更持久、更清晰。
Edman降解法殘基轉(zhuǎn)化過(guò)程
通過(guò)有機(jī)溶劑，乙酸乙酯或氯丁烷，萃取，將ATZ殘基與肽分離，然后將其向更穩(wěn)定的苯硫代乙內(nèi)酰脲（PTH）形式轉(zhuǎn)化，以更好的進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)化過(guò)程在含酸水溶液（25％TFA）中完成。一些經(jīng)修飾的氨基酸殘基（例如糖基化的天冬酰胺基）可能難溶于有機(jī)溶劑，因此在其序列中的相應(yīng)點(diǎn)處顯示空白。在固相測(cè)序中，當(dāng)肽與固相支持物共價(jià)連接時(shí)，可以嘗試其它ATZ殘基的提取方法，但要注意的是，剩余的肽段不能被萃取或丟失（造成產(chǎn)量大幅度下降）。
Edman降解法PTH殘基分析
由Edman降解的每個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的PTH殘基通常用使色譜法進(jìn)行鑒定，最初是薄層色譜法，后來(lái)是反相高效液相色譜法。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，依次鑒定和定量來(lái)自每個(gè)循環(huán)的PTH氨基酸殘基，并按從N端到C端的殘基順序描述序列。如果存在放射性氨基酸殘基，則可以通過(guò)此階段的活性來(lái)檢測(cè)它們。
北京百泰派克生物科技有限公司采用島津公司的Edman測(cè)序系統(tǒng)，能測(cè)定N端30個(gè)氨基酸的序列信息。采用其特定的蛋白上樣系統(tǒng)，可以測(cè)定N端的60-70個(gè)氨基酸。同時(shí)，百泰派克還建立了以先進(jìn)的LC-MS/MS技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)N端測(cè)序的平臺(tái)，可以測(cè)出封閉和修飾的蛋白質(zhì)末端，與Edman降解法形成互補(bǔ)，使得N端測(cè)序能順利進(jìn)行。