?大家好，這里是只想咕咕的椰球。今天為大家帶來一篇輕松有趣的論文，標題為生酮飲食在阿爾茨海默小鼠模型中緩解認知損傷并減輕炎癥反應。本文刊載于Wiley旗下的雜志CNS neuroscience & therapeutic。自2008年創立以來，這本刊物的影響因子一直不溫不火地徘徊在3-4的區間。但是從18-19年開始本刊發展勢頭迅猛，影響因子一路上漲，截至今年已經突破7。本文的第一作者許云龍博士和通訊作者朱英杰研究員均來自中科院深圳先進技術研究院。

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引言

“生酮飲食”是近幾年非常受關注的一種膳食減肥策略，指的是一種嚴格的低碳水，高脂肪飲食方式。所謂“生酮”指的就是產生酮體（以丙酮酸和β-羥基丁酸為主），用脂肪代謝產生的酮體而不是葡萄糖為身體供能。自上世紀20年代被引入，生酮飲食已經被證明是一種有效的應對兒童難治性癲癇的療法。目前生酮飲食治療癲癇的原理尚未明確，不過科學家普遍認為生酮飲食可以增加體內γ-氨基丁酸（GABA）水平從而降低神經元興奮度，同時還具備調節腸道菌群的作用。除此之外其他研究也表明，生酮飲食可以起到抗炎、抗氧化等神經保護作用，這提示生酮飲食除了可以治療癲癇，還有可能對其他神經退行性疾病產生保護和治療作用。

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阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是世界第一大神經退行性疾病，威脅著數千萬老齡人群的身體健康和生活質量。AD的發病機理仍未完全清楚，但是普遍認為和神經炎癥存在千絲萬縷的聯系。因此生酮飲食作為治療阿爾茨海默病的療法，其潛力值得探索。

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在本文中，研究者探討了生酮飲食對阿爾茨海默模型小鼠的治療作用。利用5xFAD模型鼠以及多種行為學、組織學手段，作者發現生酮飲食干預可以顯著減輕AD模型鼠的神經炎癥，阻止AD模型鼠神經元和突觸的丟失從而減輕AD模型鼠的認知功能損傷。

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結果

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為了在模式動物中模擬阿爾茨海默病的病理特征，多種AD動物模型已經被開發出來。目前最廣泛被使用AD動物模型是轉基因小鼠模型。如APP/PS1、3xTG等攜帶AD致病突變體的轉基因小鼠模型都已經為人熟知了。在本研究中作者使用的5xFAD鼠攜帶了5種人源的家族性AD相關突變基因，屬于AD疾病進展最快的轉基因鼠模型之一。在本文的研究中，模型動物和對照動物被分為3組，分別為AD+KD（模型鼠+生酮飲食）、AD+SD（模型鼠+標準飲食）和WT+SD（野生型鼠+標準飲食），是一個比較標準的實驗組+陽性對照+陰性對照的分組設計。飲食干預從動物7月齡時開始，此時5xFAD鼠已經表現出了嚴重的AD表型（圖 1A）。在連續四個月對模型鼠進行生酮飲食干預后，研究者使用不同的行為學范式對各組動物的學習記憶和運動能力進行了測試。

圖1 本文實驗流程圖，包含飲食干預和行為測試

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首先，作者使用曠場實驗（open filed test，OFT）檢驗了各組小鼠的運動能力和焦慮水平。結果表明三組動物在曠場中的平均運動速度和總運動距離未表現出顯著差別（圖 2A和B），這提示動物的運動能力和運動意愿均未因品系和飲食干預而發生顯著改變。同時三組動物在曠場中心活動的時間和進入曠場中心的次數也未表現出顯著區別，這表明不同品系動物或不同飲食干預均未對動物的焦慮水平產生顯著影響。

圖2 曠場實驗檢測不同飲食干預的AD模型鼠和野生鼠的運動能力和焦慮水平

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在確認動物的運動和情緒水平未受改變后，研究者對動物的學習記憶能力進行了檢驗。

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當研究動物學習記憶能力時我們通常會設置“一長一短”兩種行為范式。具體而言，我們分別需要分別設置一個長期記憶（參考記憶）科目和一個短期記憶（工作記憶）科目，通過兩種行為學實驗的結果交叉驗證從而闡明不同組別動物之間學習記憶能力的差別。

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在本研究中，作者使用Barnes迷宮對動物的空間學習記憶能力進行測試（圖 3B）。Barnes迷宮可以被看為是Morris水迷宮的陸地版，相比水迷宮實驗，Barnes迷宮對動物的體能消耗更小，動物的應激水平也更低。另外，研究者選用T迷宮作為工作記憶的范式（圖 3F）。T迷宮，或者與其相似的Y迷宮都是檢驗動物工作記憶的常用范式。研究者在本文設計了一個“延遲非配對”任務訓練動物在兩次連續的試驗中分別向迷宮的兩臂移動。

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Barnes迷宮的結果表明，經過8天的訓練后，野生型鼠和以生酮飲食喂養的AD模型鼠的平均逃避潛伏期均降至50s以內，而正常飲食的AD模型鼠逃避潛伏期依然保持在100s以上（圖 3C）。在空間探索測試中，AD模型鼠首次進入藏身洞的時間顯著長于野生鼠，在目標象限探索的時間比例也顯著短于野生鼠（圖 3D和3E）。然而，使用生酮飲食干預則使得AD模型鼠在Barnes迷宮的兩個評價指標中均優于普通飲食組模型鼠。

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同時，T迷宮實驗的結果與Barnes迷宮的結果相吻合。普通飲食處理的AD模型鼠在任務正確率上顯著低于野生型對照鼠，而生酮飲食組AD模型鼠在T迷宮中的任務正確率則相比普通飲食組存在顯著的提升（圖 3G）。

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綜上，在AD模型鼠發病之后采取生酮飲食干預使得模型鼠的認知障礙癥狀得到了顯著的緩解，提示生酮飲食治療AD導致認知損傷治療方案的潛力。

圖3 生酮飲食可以緩解5xFAD模型鼠的認知功能損傷

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除了認知障礙外，皮層和海馬區神經元的丟失和突觸的損傷也是AD的典型癥狀。因此研究者接下來在檢驗了生酮飲食干預對神經元和突觸的保護效果。首先，作者分別使用突觸素（Synaptophysin）和PSD95兩種抗體對海馬齒狀回組織的切片進行免疫熒光染色。突觸素是突觸前小泡的標志蛋白，而PSD95是突觸后致密帶蛋白，兩種抗體分別代表了突觸的兩個組成部分。結果顯示，無論是突觸素還是PSD95，在AD模型鼠中量的相比野生鼠均顯示出顯著的下降，表明隨著AD病程的進展所表現出的突觸缺失（圖 4A和C）。而在生酮飲食干預的AD模型鼠中兩種標志蛋白的斑塊數量相比普通飲食的模型鼠均表現出一定的回升（圖 4B和D），提示生酮飲食干預可以部分阻止5xFAD鼠中突觸的損傷。

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同時，使用成熟神經元標志物NeuN免疫熒光染色，研究者還檢驗了生酮飲食對AD模型鼠中神經元丟失的保護作用。結果顯示，11月齡的5xFAD鼠中發生了神經元大量缺失的現象，而生酮飲食則在一定程度上抑制了NeuN陽性細胞丟失的現象（圖 4E-H）。

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為了判定突觸的缺失原發還是是由神經元死亡所導致的，研究者使用高爾基銀染的辦法對皮層和海馬區幸存神經元樹突的形態進行了觀察（圖 4I）。結果表明AD模型鼠中單位長度樹突棘的密度顯著低于野生鼠，而在生酮飲食處理的AD模型鼠中樹突棘的密度則得到了有效的恢復（圖 4J）。以上結果進一步證明生酮飲食可以在一定程度上阻止AD模型鼠中突觸和神經元的損傷。

圖4 生酮飲食阻止了AD模型鼠中神經元和突觸的丟失

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除了細胞丟失和認知障礙外，AD的典型病理特征還包括β-淀粉樣蛋白（β amyloid，Aβ）的沉積、tau蛋白的纏結以及小膠質細胞的激活等。因此在接下來的研究中，作者對這幾項指標進行了檢測。免疫熒光結果表明，普通飲食組AD模型鼠中出現了大量Aβ斑塊積累，而生酮飲食處理的AD模型鼠中Aβ斑塊的面積則顯著更?。▓D 5A和B）。小膠質細胞標志物Iba-1染色的結果表明AD模型鼠中小膠質細胞的激活水平顯著高于野生鼠，形態也顯著膨大（圖5C和E）；而生酮飲食處理的AD模型鼠中小膠質細胞的激活水平和形態則與野生鼠相當（圖 5C和D）。同時，研究者還檢查了腦組織中部分炎性因子的表達水平，ELISA結果顯示在皮層和海馬兩個腦區中，生酮飲食干預均可以顯著減輕AD模型引發的IL-1β和TNF-α表達量的上升（圖 5G-5J）。

圖5 生酮飲食可以減輕5xFAD小鼠中 Aβ的沉積和小膠質細胞的活化

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綜上，本文使用阿爾茨海默模型小鼠，通過多種行為學和病理手段檢測了生酮飲食法對阿爾茨海默模型小鼠的治療作用。本文的研究內容并不復雜，但是研究和行文的思路清晰，所采用的研究方法全面包含了阿爾茨海默藥效研究的各個方面。我們將本文中所采用的動物模型和研究方法整理在下表中，希望對有AD相關療法評篩需求的朋友們有所幫助。

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