?TUNEL?法測凋亡操作步驟

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一、TUNEL檢測原理

??????TUNEL?細胞凋亡檢測試劑盒是采用非同位素方法來檢測細胞在凋亡過程中DNA?的斷裂情況，可在原位快速準確地檢測單個凋亡細胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細胞樣本（細胞涂片）的凋亡原位檢測。

?????其原理是細胞凋亡發生時，內源性核酸酶激活，使DNA的雙鏈斷裂或一條鏈出現缺口，產生一系列3’-OH末端，在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶（TdT）作用下，組織細胞原位DNA切口可被標記上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal?deoxynucleotidyl?Transferase?Biotin-dUTP?Nick?End?Labeling），可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯苯胺（DAB）的存在下，顯示為棕色（過氧化物酶活性），特異準確地定位正在凋亡的細胞，在普通顯微鏡下即可觀察和計數凋亡細胞；由于正的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA?的斷裂，因而沒有3'-OH?形成，很少能夠被染色。

二、試劑盒組份

???????組???份????????? 10?assays?????????????25?assays???????????????儲存條件

A：Equilibration?Buffer???????????????????????????1.0?mL??????????????????2.5?mL????????????????????-20?℃??????????

B：Biotinylated?Nucleotide?Mix???????????????10?μL????????????????????25?μL?????????????????????-20?℃

C：TdT?Enzyme????????????????????????????????????10?μL????????????????????25?μL?????????????????????-20?℃??????????

D：500×Proteinase?K????????????????????? 10?μL????????????????????25?μL?????????????????????-20?℃

???????20×SSC???????????????????????????????????????15?mL???????????????????38?mL?????????????????????4?℃

E：Streptavidin-HRP??????????????????????????????10?μL???????????????????25?μL???????????????????????4?℃

F：20×DAB?Substrate?Buffer?????????????????50?μL??????????????????125?μL??????????????????? 4?℃???????????

G：20×DAB?Chromogen???????????????????????50?μL??????????????????125?μL?????????????????? 4?℃

H：20×Hydrogen?Peroxide????????????????????50?μL??????????????????125?μL?????????????????? 4?℃

三、操作流程

1.操作流程概覽

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2.細胞樣本制備

準備：

????●?PBS：8.0g?NaCl，?0.2?g?KCl，?1.44g?Na2HPO4，0.24g?KH2PO4，溶于800ml去離子水中，HCl調pH至7.4，加水定容至1L。

????●?固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；

????●?封閉液：3%H2O2溶于甲醇；

????●?細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；

操作步驟：

1)經過實驗處理的細胞爬片或細胞涂片，自然晾干；

2)室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；

3)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；

4)浸入細胞膜通透液中，室溫30sec~2min；

5)進行標記反應。

3.石蠟包埋組織切片預處理

準備：

????●?石蠟切片脫蠟至水：二甲苯脫蠟2×10min，梯度乙醇水合（100%、95%、90%、80%、70%）；

????●?蛋白酶K工作液：2?μL500×蛋白酶K?+?998?μL?PBS；

????●?固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；

????●?封閉液：3%H2O2溶于甲醇。

操作步驟：

1)石蠟包埋的組織切片按常規方法脫蠟至水；

2)PBS漂洗3×5min；

3)加入蛋白酶K工作液，37℃反應15~30min；PBS漂洗3×5min；

4)（選擇進行）室溫固定15min~30min；PBS漂洗3×5min；

5)浸入封閉液中，室溫封閉10min，PBS漂洗3×5min；

6)進行標記反應。

4.冰凍組織切片預處理

準備：

????●?固定液：4%多聚甲醛溶于pH7.4的PBS中，新鮮配制；

????●?封閉液：3%H2O2溶于甲醇；

????●?細胞膜通透液：0.1%TritonX-100溶于PBS，新鮮配制；

操作步驟：

1)冰凍切片浸入固定液，室溫固定10min；PBS漂洗3×5min；

2)浸入封閉液中，室溫封閉10min；PBS漂洗3×5min；

3)浸入通透液中，室溫30sec~2min；

4)進行標記反應。

5.陽性對照和陰性對照的準備

TUNEL檢測時需要設立陽性對照和陰性對照，以顯示實驗的客觀性和準確性。

1)陽性對照樣本的處理（選擇進行）

???DNaseI反應液（用戶自備）：?（10U-3000U?DNase?I；40mM?Tris-HCl?pH?7.9；?

???????????????????????????????????????????????????10?mM?NaCl；6mM?MgCl2；10mM?CaCl2）

組織樣本經過蛋白酶K處理或者通透液處理，PBS浸洗后，加入100?μL?DNaseI反應液，室溫孵育10~30min，用去離子水徹底清洗玻片，浸入PBS漂洗5min，進行標記反應。

2)陰性對照樣本的處理

???在進行標記反應過程配制TdT酶反應液時，不加入TdT酶，其余步驟相同。

四、標記和顯色反應

以下操作在濕盒內進行。

1.預處理好的樣本經過PBS漂洗后，用濾紙輕輕吸去樣本周圍液體；

2.每個樣本滴加100?μL?TdT酶反應液，于37＆#61616;C避光反應60min；

TdT酶反應液的準備（即用即配）：

??成分????????????????????????????????????????標準100?μL/片????????切片數????????總體積

??Equilibration?Buffer????????????????????98?μL?????????????????????×????????????????=

??Biotinylated?Nucleotide?Mix????????1?μL??????????????????????×????????????????=

??TdT?Enzyme?????????????????????????????1?μL??????????????????????×????????????????=

陰性對照片不加TdT酶。

3.用去離子水按1：10稀釋20×SSC，進行終止反應，室溫15min；然后PBS漂洗3×5min；

4.浸入0.3%H2O2/PBS中封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3~5min；PBS漂洗3×5min；

5.滴加100?μL?Streptavidin-HRP工作液（按1：500稀釋為工作液），于37℃反應30~60min；

6.PBS漂洗3×5min；

7.滴加DAB顯色液：

??成分?????????????????????????????????????????100?μL/片???????切片數?????總體積

??20×DAB?Substrate?Buffer?????????????5???????????????????×?????????????=

??20×DAB?Chromogen????????????????????5???????????????????×????????????=

??20×Hydrogen?Peroxide?????????????????5??????????????????×????????????=

??ddH2O????????????????????????????????????????85??????????????????×????????????=

8.用去離子水漂洗數次；（選擇進行復染細胞核）；

9.中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。

注意事項：

1.PBS清洗后，請盡量去除PBS液體再進行下一步反應；

2.避免載波片上的樣本干燥造成實驗失敗；

3.TdT酶反應液應即用即配，在冰上進行，不宜長期保存；

4.復染細胞核可以用甲基綠染液（用戶自備）。

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參照圖