題 記
在過去的十年里，細胞治療和基因治療研究領(lǐng)域取得了顯著進展，為全世界展示了疾病治療的美好前景，也給許多正在遭受疑難雜癥困擾的患者提供了新的希望。細胞治療產(chǎn)品的研發(fā)與評價也日益受到國內(nèi)外制藥企業(yè)及法規(guī)部門的高度關(guān)注，《細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術(shù)指導原則》的制定，旨在進一步規(guī)范細胞治療產(chǎn)品的研發(fā)，提高其安全性、有效性和質(zhì)量可控性水平，從而推動和促進我國細胞治療領(lǐng)域的健康發(fā)展。對于細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)過程中使用到的任何物料、生產(chǎn)工藝等均要遵從《藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范》的基本規(guī)范和相關(guān)原則。其中涉及到細胞培養(yǎng)試劑的監(jiān)管要求更是需要成分明確、無動物源，并有可追溯性文件等。本文主要給大家介紹Biolaminin產(chǎn)品在支持細胞大規(guī)模生產(chǎn)方面的應用，為制造符合臨床標準的干細胞治療產(chǎn)品提供良好的細胞外基質(zhì)環(huán)境。
人源重組層粘連蛋白
支持細胞大規(guī)模生產(chǎn)的應用
1、基于Biolaminin 521的微載體系統(tǒng)用于人多能干細胞的生產(chǎn)
Biolaminin 521被證明是多能干細胞在微載體附著和生長的最佳細胞外基質(zhì)底物。
圖1 A）HES-3人多能干細胞在不同包被基質(zhì)上培養(yǎng)7天的細胞密度比較（PLL=poly-L-lysine, LN=laminin-111）。B）利用Biolaminin 521微載體系統(tǒng)支持hES細胞的最佳生長，不需要額外的正電荷（PLL或Plastic Plus）來防止預聚集（PS=non-porous polystyrene MCs；Plastic=porous crosslinked polystyrene MCs）
2、Biolaminin 521包被微載體用于人多能性干細胞擴大生產(chǎn)臨床性紅細胞
從人多能性干細胞分化而來的通用性紅細胞在輸血醫(yī)學中具有重要的應用價值。考慮到每個輸血單位需要2萬億個紅細胞，亟需開發(fā)有效的生物工藝來體外大規(guī)模生產(chǎn)紅細胞。
圖2 利用Biolaminin 521包被培養(yǎng)的iPSC在125 mL旋轉(zhuǎn)瓶分化紅細胞連續(xù)攪拌培養(yǎng)的過程示意圖，以及相應聚集的細胞情況觀察
其它相關(guān)應用可供參考文獻：
[1] Sivalingam J, Lam AT, Chen HY, et al. Superior Red Blood Cell Generation from Human Pluripotent Stem Cells Through a Novel Microcarrier-Based Embryoid Body Platform. Tissue Eng Part C Methods. 2016 Aug; 22(8): 765-80.
[2] Yu S, Vassilev S, Lim ZR, et al. Selection of O-negative induced pluripotent stem cell clones for high-density red blood cell production in a scalable perfusion bioreactor system. Cell Prolif. 2022 Aug; 55(8): e13218.
3、Biolaminin 521作為一種良好的中空纖維包被基質(zhì)，用于封閉系統(tǒng)中iPSC的大規(guī)模擴增
本研究建立了一個封閉的功能系統(tǒng)，為hiPSC的大規(guī)模擴增提供了必要的環(huán)境，同時可保持其干性。研究結(jié)果顯示，在Biolaminin 521包被的中空纖維體系中，與Vitronectin（VN）相比可產(chǎn)生高質(zhì)量的hiPSCs，且細胞相關(guān)參數(shù)與表征均與Matrigel包被培養(yǎng)的細胞進行比較，也顯示良好的性能。綜上，本文研究證明中空纖維系統(tǒng)可以用于高效、可重復的hiPSC大規(guī)模擴增，同時保留干細胞的表型與干性。臨床批準的中空纖維系統(tǒng)與無動物源成分的Biolaminin細胞外基質(zhì)的聯(lián)合，提供了一種大規(guī)模擴增hiPSC的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，為下游的疾病治療等生物工程研究提供高質(zhì)量的細胞來源。
圖3 中空纖維系統(tǒng)不同包被基質(zhì)下iPSC細胞的生長情況
圖4 不同基質(zhì)包被下，iPSC三胚層分化的鑒定情況
圖5 Biolaminin 521包被可顯著提高iPSC的增殖能力
4、利用Biolaminin 521包被微載體將干細胞分化為巨核細胞，用于出血性疾病的血小板輸注
迄今為止，懸浮培養(yǎng)的生物反應器設備，包括純細胞聚集（Cell-only aggregates, cell-OA）、微載體培養(yǎng)（Microcarriers, MCs）、細胞封裝等，在hPSC的擴增和分化為特定細胞類型等方面已經(jīng)顯示出良好的結(jié)果。
本研究中，在攪拌式旋轉(zhuǎn)瓶生物反應器中使用基于微載體的iPSC分化為巨核細胞（megakaryocyte, MK），以供下游應用。如圖6所示，在整個分化生產(chǎn)過程中，iPSC接種在Biolaminin 521包被的MCs上。在攪拌懸浮系統(tǒng)中分化了22天，產(chǎn)生了大量的MKs，可以很容易地從細胞上清中收獲。MKs再經(jīng)過后續(xù)的培養(yǎng)與成熟，可用于生產(chǎn)血小板（Platelet, PLT）或作為輸血中PLT的替代品。
圖6 攪拌式旋轉(zhuǎn)生物反應器中分化生產(chǎn)MKs的工藝流程圖
圖7 在攪拌式旋轉(zhuǎn)瓶中分化的MK表型和數(shù)量的表征（左圖）；iPSC分化的Mks在攪拌式旋轉(zhuǎn)瓶中分化后顯示出形成proPLT的能力（右圖）
參考文獻
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[2] Paccola Mesquita FC, Hochman-Mendez C, Morrissey J,?et al.?Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System.?Stem Cells Int.?2019 Jan 22; 2019: 9704945.
[3] Eicke D, Baigger A, Schulze K,?et al.?Large-scale production of megakaryocytes in microcarrier-supported stirred suspension bioreactors.?Sci Rep.?2018 Jul 5; 8(1): 10146.
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