白內障是一種晶狀體蛋白質發生異常聚集并導致晶狀體混濁的眼科疾病，是全球最常見的致盲原因之一。電子時代的迅猛發展不得不引起我們對眼睛健康的重視。目前的治療手段主要依賴手術切除渾濁的晶狀體，但其高昂的費用及手術風險使得非手術治療手段的開發顯得尤為重要。近期，浙江大學醫學院附屬第二醫院眼科中心聯合美國國立衛生研究院（NIH）國家眼科研究所（NEI）在《The Journal of Clinical Investigation》上發表了一項重要研究，發現地松鼠（GS,Ictidomys tridecemlineatus)晶狀體在低溫（4℃）時變得混濁，但在重新加熱至37℃后迅速恢復透明，這種可逆性變化背后隱藏著一個關鍵分子——RNF114。RNF114（RING Finger Protein 114）是一種含有RING指結構域的E3泛素連接酶，主要參與細胞的蛋白質降解和信號傳導過程。它通過將泛素分子標記到特定的靶蛋白上，調控靶蛋白的穩定性、活性或亞細胞定位，從而影響多種細胞功能。該研究首次揭示了RNF114在調控晶狀體蛋白溫度依賴性變化中的核心作用，為開發白內障非侵入性治療提供了潛在靶點。這一發現不僅刷新了我們對白內障病理機制的理解，也有望推動全新治療藥物的研發，拓展了我們對白內障發病機制理解同時，也為非手術治療白內障帶來了新的希望。
圖1
一、樣本選擇
GS衍生的誘導多能干細胞（GS iPSCs）構建了GS衍生誘導晶狀體上皮細胞（iLEC）；人晶狀體細胞（HLECs）；GSs和大鼠含有晶狀體上皮細胞的晶狀體囊組織鑒定蛋白組學檢測
二、技術手段
1、qPCR：檢測iLEC模型中晶狀體蛋白的表達；
2、TMT-定量蛋白組學技術：檢測GSs和大鼠低溫模型中晶狀體差異蛋白；
3、Pull down-MS/Coip-WB：檢測特定基因表達情況；
4、免疫熒光成像
5、細胞活性檢測
三、研究結果
1、GS晶狀體不透明在低溫再溫周期中被逆轉
文章發現GS冬眠/昏睡時，GS晶狀體變得不透明；醒來后，晶狀體迅速完全恢復其透明度（圖2A）。為了證實GS的獨特適應性，文章比較了GS和大鼠在低溫復溫處理下離體晶狀體的透明度。生理狀態下，大鼠晶狀體透明無色；GS透鏡也是透明的，但顏色是淡黃色。GS和大鼠晶狀體在4℃下處理24小時均出現明顯的低溫白內障，以中央核混濁為主。隨后，在37℃下再加熱約5分鐘后，GS鏡片的混濁現象完全消除，透過率恢復到低溫處理前的水平。相比之下，大鼠晶狀體保留了明顯的核不透明，透過率僅恢復到86%，延長復溫時間并沒有進一步顯著提高清晰度（圖2B-D）。
圖2. 地松鼠和大鼠的晶狀體在低溫和復溫后的透明度結果
2、蛋白組學技術發現UPS促進了聚集的晶體蛋白的降解
GS衍生的誘導多能干細胞（GS iPSCs）體外誘導建立iLEC細胞模型，并通過晶狀體蛋白（CRYAA/CRYAB/CRYBB2等）表達量增多來表示建模成功。
為了進一步探討冬眠動物晶狀體冷適應的具體機制，文章采用TMT蛋白組學方法對GS和大鼠含有晶狀體上皮細胞的晶狀體囊組織進行了檢測和分析。結果發現蛋白質泛素化、泛素-蛋白連接酶活性和蛋白酶體泛素依賴的蛋白質僅在復溫后的GS中顯著富集（圖3A）；參與泛素化蛋白降解（UPS）過程的各種E1、E2和E3酶明顯上調（圖3B），根據這些結果，文章推測在低溫-復溫周期中，GS晶狀體不透明逆轉的機制可能與泛素-蛋白酶體途徑介導的蛋白質降解有關。之前的研究說明蛋白質是通過哺乳動物細胞的UPS或自噬降解的，文章使用這兩種途徑的抑制劑，觀察到重新加熱后突變體CRYAA（Y118D）水平的降低被蛋白酶體抑制劑MG132顯著抑制；活細胞成像也顯示，MG132能抑制突變體αA-晶體蛋白和αB-晶體蛋白熒光斑點的消除。這些觀察結果表明，蛋白酶體的UPS對突變體αA-晶體蛋白的清除至關重要，而非溶酶體的自噬對其沒有影響（圖3 I-L）。
圖3. 蛋白質復合物在DNA復制脅迫下有可能改變組裝狀態
3、RNF114在GS iLECs的低溫升溫過程中促進CRYAA泛素化
內源結晶蛋白的穩定性研究結果表明，在低溫-復溫循環中，只有CRYAA形成了顯著的聚集體；CRYAB、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和γ-結晶蛋白沒有明顯聚集（圖4A）。因此，對于內源性CRYAA，文章通過免疫熒光和共免疫沉淀（CO-IP）證實了它與泛素的相互作用（圖4B-D）。在復溫后，通過CO-IP觀察到GS iLECs中CRYAA多泛素化水平的增加。免疫熒光進一步驗證泛素與CRYAA熒光點共定位。為了確定在低溫復溫過程中與CRYAA相互作用的潛在E3泛素連接酶，文章使用了內源性CRYAA下拉和質譜實驗，結果發現了100多個在重新加熱組中特異性結合CRYAA的蛋白，其中一個被稱為RNF114的蛋白已被報道具有E3泛素連接酶活性。為了進一步研究RNF114對晶狀體混濁逆轉的影響，文章對RNF114的mRNA水平以及互作蛋白分析，在低溫復溫前后進行了對比，結果發現RNF114的mRNA水平在GS iLECs中升高，這表明RNF114可能在GS晶狀體的適應性調節中發揮特定作用（圖4E）。Co-IP進一步證實了RNF114和CRYAA在GS iLECs復溫后的相互作用（圖4F-H）。RNF114的下調導致CRYAA多泛素化減少，而RNF114 WT的過表達顯著促進了CRYAA（Y118D）水平的降低。后續文章構建了RNF114ΔC(1-200)，它缺乏泛素結合所需的泛素相互作用基序結構域（圖4I），結果發現RNF114ΔC的引入并沒有提高CRYAA的表達量（圖4I-L）。結果證明了RNF114能夠促進HLECs中CRYAA蛋白酶體降解。
圖4. NF114在GS iLECs的低溫升溫過程中促進CRYAA泛素化
4、RNF114可逆轉非冬眠癥患者的白內障
文章發現RNF114不影響HLECs或GS iLECs的細胞活力（圖5，A和B），這從側面反映了使用RNF114治療低溫性白內障的安全性。為了促進RNF114向HLECs和大鼠晶狀體的遞送，文章將RNF114與一種細胞穿透肽TAT-(47-58)（該肽來源于HIV-1調節蛋白TAT，已被證實可用于多種系統，包括眼睛）結合，用免疫熒光圖像證實TAT-RNF114在孵育30分鐘后進入HLECs和離體大鼠晶狀體的細胞質中（圖5C）。接下來，將TAT或TAT-RNF114與GFP-CRYAA（Y118D）敲入的HLECs孵育4小時，觀察到細胞質中聚集的熒光斑點逐漸減少，尤其是CRYAA(Y118D) HLECs（圖5D）。隨后將大鼠晶狀體在4℃下孵育24小時，建立大鼠低溫白內障模型，觀察到TAT-RNF114處理的晶狀體的混濁迅速逆轉，而對照晶狀體的核仍保持混濁。透鏡透光率測量也驗證了TAT-RNF114處理顯著提高了大鼠在低溫復溫過程中的透鏡透光效率（圖5E）。另外文章用H2O2（氧化應激）誘導斑馬魚白內障，觀察到TAT-RNF114治療12小時后晶狀體混濁降低，而TAT-RNF114ΔC組和TAT對照組沒有表現出這種效果，并且5只斑馬魚中有4只在晶狀體混濁分類系統III （LOCS III）中至少有1級的透明度改善（圖5F），表明RNF114可以緩解除寒冷以外的壓力引起的晶狀體混濁。
圖5. RNF114治療低溫性白內障的安全性及可逆轉非冬眠癥患者的白內障
研究結論：
多種因素引起的蛋白穩態紊亂和蛋白聚集異常是白內障形成的根本病理改變，文章通過研究地松鼠的晶狀體的可逆性溫度依賴性清晰度變化的機制，發現其主要依賴于復溫期間UPS對CRYAA聚集體的上調，新發現的RNF114在聚集體降解和周轉中起核心作用，對不同應激性白內障模型有顯著可逆性影響?；蛟S通過篩選和設計刺激特定蛋白質降解途徑的藥物有助于精確調節蛋白質的穩定性和周轉，從而有可能推動蛋白質穩態維持和蛋白質聚集性疾病治療的進展。
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表1
參考文獻：The Journal of Clinical Investigation ( IF 13.3 ) Pub Date : 2024 Sep 17 , DOI: 10.1172/jci169666
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