白內(nèi)障是一種晶狀體蛋白質(zhì)發(fā)生異常聚集并導(dǎo)致晶狀體混濁的眼科疾病，是全球最常見的致盲原因之一。電子時(shí)代的迅猛發(fā)展不得不引起我們對眼睛健康的重視。目前的治療手段主要依賴手術(shù)切除渾濁的晶狀體，但其高昂的費(fèi)用及手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)使得非手術(shù)治療手段的開發(fā)顯得尤為重要。近期，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院眼科中心聯(lián)合美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）國家眼科研究所（NEI）在《The Journal of Clinical Investigation》上發(fā)表了一項(xiàng)重要研究，發(fā)現(xiàn)地松鼠（GS,Ictidomys tridecemlineatus)晶狀體在低溫（4℃）時(shí)變得混濁，但在重新加熱至37℃后迅速恢復(fù)透明，這種可逆性變化背后隱藏著一個(gè)關(guān)鍵分子——RNF114。RNF114（RING Finger Protein 114）是一種含有RING指結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶，主要參與細(xì)胞的蛋白質(zhì)降解和信號傳導(dǎo)過程。它通過將泛素分子標(biāo)記到特定的靶蛋白上，調(diào)控靶蛋白的穩(wěn)定性、活性或亞細(xì)胞定位，從而影響多種細(xì)胞功能。該研究首次揭示了RNF114在調(diào)控晶狀體蛋白溫度依賴性變化中的核心作用，為開發(fā)白內(nèi)障非侵入性治療提供了潛在靶點(diǎn)。這一發(fā)現(xiàn)不僅刷新了我們對白內(nèi)障病理機(jī)制的理解，也有望推動全新治療藥物的研發(fā)，拓展了我們對白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制理解同時(shí)，也為非手術(shù)治療白內(nèi)障帶來了新的希望。
圖1
一、樣本選擇
GS衍生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（GS iPSCs）構(gòu)建了GS衍生誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞（iLEC）；人晶狀體細(xì)胞（HLECs）；GSs和大鼠含有晶狀體上皮細(xì)胞的晶狀體囊組織鑒定蛋白組學(xué)檢測
二、技術(shù)手段
1、qPCR：檢測iLEC模型中晶狀體蛋白的表達(dá)；
2、TMT-定量蛋白組學(xué)技術(shù)：檢測GSs和大鼠低溫模型中晶狀體差異蛋白；
3、Pull down-MS/Coip-WB：檢測特定基因表達(dá)情況；
4、免疫熒光成像
5、細(xì)胞活性檢測
三、研究結(jié)果
1、GS晶狀體不透明在低溫再溫周期中被逆轉(zhuǎn)
文章發(fā)現(xiàn)GS冬眠/昏睡時(shí)，GS晶狀體變得不透明；醒來后，晶狀體迅速完全恢復(fù)其透明度（圖2A）。為了證實(shí)GS的獨(dú)特適應(yīng)性，文章比較了GS和大鼠在低溫復(fù)溫處理下離體晶狀體的透明度。生理狀態(tài)下，大鼠晶狀體透明無色；GS透鏡也是透明的，但顏色是淡黃色。GS和大鼠晶狀體在4℃下處理24小時(shí)均出現(xiàn)明顯的低溫白內(nèi)障，以中央核混濁為主。隨后，在37℃下再加熱約5分鐘后，GS鏡片的混濁現(xiàn)象完全消除，透過率恢復(fù)到低溫處理前的水平。相比之下，大鼠晶狀體保留了明顯的核不透明，透過率僅恢復(fù)到86%，延長復(fù)溫時(shí)間并沒有進(jìn)一步顯著提高清晰度（圖2B-D）。
圖2. 地松鼠和大鼠的晶狀體在低溫和復(fù)溫后的透明度結(jié)果
2、蛋白組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)UPS促進(jìn)了聚集的晶體蛋白的降解
GS衍生的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（GS iPSCs）體外誘導(dǎo)建立iLEC細(xì)胞模型，并通過晶狀體蛋白（CRYAA/CRYAB/CRYBB2等）表達(dá)量增多來表示建模成功。
為了進(jìn)一步探討冬眠動物晶狀體冷適應(yīng)的具體機(jī)制，文章采用TMT蛋白組學(xué)方法對GS和大鼠含有晶狀體上皮細(xì)胞的晶狀體囊組織進(jìn)行了檢測和分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)泛素化、泛素-蛋白連接酶活性和蛋白酶體泛素依賴的蛋白質(zhì)僅在復(fù)溫后的GS中顯著富集（圖3A）；參與泛素化蛋白降解（UPS）過程的各種E1、E2和E3酶明顯上調(diào)（圖3B），根據(jù)這些結(jié)果，文章推測在低溫-復(fù)溫周期中，GS晶狀體不透明逆轉(zhuǎn)的機(jī)制可能與泛素-蛋白酶體途徑介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解有關(guān)。之前的研究說明蛋白質(zhì)是通過哺乳動物細(xì)胞的UPS或自噬降解的，文章使用這兩種途徑的抑制劑，觀察到重新加熱后突變體CRYAA（Y118D）水平的降低被蛋白酶體抑制劑MG132顯著抑制；活細(xì)胞成像也顯示，MG132能抑制突變體αA-晶體蛋白和αB-晶體蛋白熒光斑點(diǎn)的消除。這些觀察結(jié)果表明，蛋白酶體的UPS對突變體αA-晶體蛋白的清除至關(guān)重要，而非溶酶體的自噬對其沒有影響（圖3 I-L）。
圖3. 蛋白質(zhì)復(fù)合物在DNA復(fù)制脅迫下有可能改變組裝狀態(tài)
3、RNF114在GS iLECs的低溫升溫過程中促進(jìn)CRYAA泛素化
內(nèi)源結(jié)晶蛋白的穩(wěn)定性研究結(jié)果表明，在低溫-復(fù)溫循環(huán)中，只有CRYAA形成了顯著的聚集體；CRYAB、CRYBB1、CRYBB2、CRYBB3和γ-結(jié)晶蛋白沒有明顯聚集（圖4A）。因此，對于內(nèi)源性CRYAA，文章通過免疫熒光和共免疫沉淀（CO-IP）證實(shí)了它與泛素的相互作用（圖4B-D）。在復(fù)溫后，通過CO-IP觀察到GS iLECs中CRYAA多泛素化水平的增加。免疫熒光進(jìn)一步驗(yàn)證泛素與CRYAA熒光點(diǎn)共定位。為了確定在低溫復(fù)溫過程中與CRYAA相互作用的潛在E3泛素連接酶，文章使用了內(nèi)源性CRYAA下拉和質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了100多個(gè)在重新加熱組中特異性結(jié)合CRYAA的蛋白，其中一個(gè)被稱為RNF114的蛋白已被報(bào)道具有E3泛素連接酶活性。為了進(jìn)一步研究RNF114對晶狀體混濁逆轉(zhuǎn)的影響，文章對RNF114的mRNA水平以及互作蛋白分析，在低溫復(fù)溫前后進(jìn)行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNF114的mRNA水平在GS iLECs中升高，這表明RNF114可能在GS晶狀體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)中發(fā)揮特定作用（圖4E）。Co-IP進(jìn)一步證實(shí)了RNF114和CRYAA在GS iLECs復(fù)溫后的相互作用（圖4F-H）。RNF114的下調(diào)導(dǎo)致CRYAA多泛素化減少，而RNF114 WT的過表達(dá)顯著促進(jìn)了CRYAA（Y118D）水平的降低。后續(xù)文章構(gòu)建了RNF114ΔC(1-200)，它缺乏泛素結(jié)合所需的泛素相互作用基序結(jié)構(gòu)域（圖4I），結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNF114ΔC的引入并沒有提高CRYAA的表達(dá)量（圖4I-L）。結(jié)果證明了RNF114能夠促進(jìn)HLECs中CRYAA蛋白酶體降解。
圖4. NF114在GS iLECs的低溫升溫過程中促進(jìn)CRYAA泛素化
4、RNF114可逆轉(zhuǎn)非冬眠癥患者的白內(nèi)障
文章發(fā)現(xiàn)RNF114不影響HLECs或GS iLECs的細(xì)胞活力（圖5，A和B），這從側(cè)面反映了使用RNF114治療低溫性白內(nèi)障的安全性。為了促進(jìn)RNF114向HLECs和大鼠晶狀體的遞送，文章將RNF114與一種細(xì)胞穿透肽TAT-(47-58)（該肽來源于HIV-1調(diào)節(jié)蛋白TAT，已被證實(shí)可用于多種系統(tǒng)，包括眼睛）結(jié)合，用免疫熒光圖像證實(shí)TAT-RNF114在孵育30分鐘后進(jìn)入HLECs和離體大鼠晶狀體的細(xì)胞質(zhì)中（圖5C）。接下來，將TAT或TAT-RNF114與GFP-CRYAA（Y118D）敲入的HLECs孵育4小時(shí)，觀察到細(xì)胞質(zhì)中聚集的熒光斑點(diǎn)逐漸減少，尤其是CRYAA(Y118D) HLECs（圖5D）。隨后將大鼠晶狀體在4℃下孵育24小時(shí)，建立大鼠低溫白內(nèi)障模型，觀察到TAT-RNF114處理的晶狀體的混濁迅速逆轉(zhuǎn)，而對照晶狀體的核仍保持混濁。透鏡透光率測量也驗(yàn)證了TAT-RNF114處理顯著提高了大鼠在低溫復(fù)溫過程中的透鏡透光效率（圖5E）。另外文章用H2O2（氧化應(yīng)激）誘導(dǎo)斑馬魚白內(nèi)障，觀察到TAT-RNF114治療12小時(shí)后晶狀體混濁降低，而TAT-RNF114ΔC組和TAT對照組沒有表現(xiàn)出這種效果，并且5只斑馬魚中有4只在晶狀體混濁分類系統(tǒng)III （LOCS III）中至少有1級的透明度改善（圖5F），表明RNF114可以緩解除寒冷以外的壓力引起的晶狀體混濁。
圖5. RNF114治療低溫性白內(nèi)障的安全性及可逆轉(zhuǎn)非冬眠癥患者的白內(nèi)障
研究結(jié)論：
多種因素引起的蛋白穩(wěn)態(tài)紊亂和蛋白聚集異常是白內(nèi)障形成的根本病理改變，文章通過研究地松鼠的晶狀體的可逆性溫度依賴性清晰度變化的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其主要依賴于復(fù)溫期間UPS對CRYAA聚集體的上調(diào)，新發(fā)現(xiàn)的RNF114在聚集體降解和周轉(zhuǎn)中起核心作用，對不同應(yīng)激性白內(nèi)障模型有顯著可逆性影響。或許通過篩選和設(shè)計(jì)刺激特定蛋白質(zhì)降解途徑的藥物有助于精確調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和周轉(zhuǎn)，從而有可能推動蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)維持和蛋白質(zhì)聚集性疾病治療的進(jìn)展。
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表1
參考文獻(xiàn)：The Journal of Clinical Investigation ( IF 13.3 ) Pub Date : 2024 Sep 17 , DOI: 10.1172/jci169666
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