說到抗體標記，我們首先提一個廣義的概念:蛋白質標記；蛋白標記應該分為結合（Binding）和偶聯（Conjugation），結合又分為特異性結合(specific binding)和非特異性結合(non-specific binding)，非特異性結合在百度百科上的定義是：某種配體與其相對應的特異性結構位點外其他無關物質(如非特異性蛋白質、容器、分離材料等)的結合，其特點是親和力低而結合容量大。非特異性結合比較典型的例子是膠體金標記，膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程，吸附機理是膠體金顆粒表面負電荷，與蛋白質的正電荷基團因靜電吸附而形成牢固結合；另外，非特異性結合比較典型的例子是ELISA實驗過程中的包被步驟。非特異性結合無處不在，ELISA實驗中經常遇到的非特異性反應，常常是由于內源如風濕因子,補體,高濃度非特異性免疫球蛋白,異嗜性抗體等引起的；在不同的pH和離子環境下，非特異性反應情況完全不同，這也是陰離子和陽離子純化的基本原理。特異性結合，指若干具有化學特性或者生物特性的有機官能團，通過高度專一而高效的連接方式結合在一起，并對外顯示生理活性或理化性質。常見的就是我們常用的蛋白純化的標簽，6His標簽，GST標簽，MBP標簽，Strep標簽等，還有生物素（biotin）與鏈霉親和素(Streptavidin)，凝集素與糖蛋白;其中生物素與鏈霉親和素其解離常數Kd≈10−14 mol/L，甚至高于抗原-抗體；特異性結合最大的案例群為抗原與抗體，所有的抗體公司所孜孜不倦苦苦上下求索追求的抗體，無非就是要找到與抗原特異性結合的特異性結合試劑（Specific Binding Reagent），所以這里也就總結出來，特異性結合的特點是專一性，排他性和高效性。
結合就相當于綁在在一起或者磁鐵吸附在一起，結合力強弱取決于磁力大小，那么偶聯就是焊接在一起，變成一個分子；不言而喻，偶聯的牢固程度和穩定性要比結合強很多，況且結合的物質在溶液中是處于一個動態的解離和結合平衡過程。蛋白質偶聯的共價偶聯常用的是氨基（-NH2）與羧基（-COOH），但是-NH2的“人緣”更好一點，現實中應用比較多。關于蛋白質偶聯和藥物方面的偶聯相對比較復雜，會用到更復雜的多步驟程序，這里不做贅述。
抗體的標記一般是用于藥物開發和免疫檢測用途；用于免疫檢測用途的抗體標記從標記物上來說，大體上分為酶類和熒光素（或熒光蛋白）；酶類標記物最為常見的是辣根過氧化物酶（HRP），其次是堿性磷酸酶（AP），其他的如β-半乳糖苷酶和葡萄糖氧化酶。
1.抗體的蛋白酶類或熒光蛋白標記
酶屬于蛋白質，其標記到抗體上，利用其與抗體表面暴露的伯氨基（-NH2）進行標記，最簡單最粗暴的標記方法是用戊二醛進行偶聯，這種標記效率低，品質控制難度比較大，其中含有大量的酶自聯或者抗體自聯，但是對于簡單的科研測試，這個標記手段無疑是最簡單快捷的。
除了粗暴的戊二醛標記法，當然也有通過交聯劑間接標記的，將兩個需要偶聯（標記）的蛋白(抗體和標記酶)，其中一個蛋白的-NH2位點上修飾為可與-SH反應的集團，另一個蛋白在伯氨基（-NH2）上修飾成-SH，兩個蛋白修飾后進行偶聯，可以實現兩個蛋白的定向偶聯，如果是抗體和酶進行偶聯的話，不會出現抗體自聯和酶自聯的情況。這種偶聯的方法被用于多肽與蛋白載體（如KLH，OVA或BSA）的偶聯，載體蛋白經過修飾成可以與-SH反應的基團，如-NHS基團，所用的修飾試劑，比如MBS（m-馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯）,多肽在合成的時候已經在C-端或者N-端預先合成一個半胱氨酸（-Cys）接頭，被修飾的蛋白載體與這個半胱氨酸（-Cys）的-SH順利對接。說到底，這個方法還是要利用蛋白表面暴露的氨基（-NH2）。我們在實踐過程中經常會被問：這個蛋白中含有10個賴氨酸，應該可以有10個-HN2位點被標記，其實這個是個誤區，蛋白經過折疊后可暴露的可用-NH2沒有這么多。
這里有個例外，因HRP分子表面含有很多糖基團，可以利用氧化的方法使其變成醛基，醛基在酸性的情況下穩定的，在遇到抗體的時候將反應條件變換成堿性，醛基與抗體分子的伯氨基，發生醛胺縮合反應：帶醛基的HRP與帶氨基的抗體通過醛基與伯氨基縮合成希夫堿而進行共價交聯，這就是經典的過碘酸鈉氧化標記法，但是這個方法對于普通實驗者來說并不友好，原因主要有以下幾點：1.市面上的HRP太多，五花八門，怎么去選擇合適的酶，RZ值和活性值（比如，>250U/mg）怎么看？當然是選擇RZ高的，活性單位高的，但是這個價格也會高，而往往實驗步驟上體現的又是mg，買到的酶偏偏是IU標注，怎么換算？2.過程控制很重要，抗體標記的過程中HRP氧化的問題，養化產物是很不穩定，我們做過測試氧化超過30分鐘，HRP很容易沉淀和失活，如果不立即用于抗體標記，存放過程HRP中逐漸聚集或者失活，這樣標記效率很低，或者說標記了很多的失活HRP到抗體上，顯示抗體效價很低；另外，抗體標記過程中的酶與抗體的量比例的問題，如果比例不對的話會造成兩個極端的結果：標記效率太低或者標記后的抗體用于實驗中背景太高。3.標記完以后，抗體標記物的保存問題，這個是個很大的問題，不正確保存的話，抗體一周內基本就會失活。所以對于初學者，實驗室不是非要建立這個標記的技術平臺的話建議買HRP抗體標記試劑盒。
說到HRP標記試劑盒，我們可能會認為買了試劑盒之后就可以實現無憂標記了，其實不然，試劑盒只是優化了很多條件，使標記實驗的風險降到最低。任何實驗都需要在實驗前認真閱讀說明書，對流程非常熟悉，特別忌諱的是說明書都沒有認真閱讀，拿到試劑盒就看一步做一步，需要提前準備的材料都沒有準備，這樣手忙腳亂的做，操作不能一氣呵成，實驗的最佳時機往往錯過了，甚至對步驟的理解錯了，實驗結果肯定不會理想。不管是用試劑盒還是自己標記，用于標記的抗體 一定要符合標準，一定要按照說明書的要求進行，抗體純化不好，抗體濃度測試不準，抗體溶液環境不對，這些都嚴重影響標記效果；簡單講一下原理，如果抗體濃度不準，你所計算的HRP與抗體配比肯定與實際不符了，標記比例不對；如果抗體純度不夠，雜質會干擾標記，很多雜質占用了HRP，造成目標抗體標記不足，這些被標記的雜質，在后期實驗過程中又會產生大量的假信號?？贵w的純化通常就是那么幾種：硫酸銨沉淀，ProteinA/G特異性親和純化，后期一般是通過透析或者脫鹽置換緩沖液至PBS環境，教科書上純化實驗過程可能不會強調透析這個步驟的重要性，或者只是簡單告訴你透析幾次，多少時間換液一次，我們仔細思考一下這個問題：我們透析液的體積是多少?透析袋里面的液體體積是多少？需要多少小時透析袋內外溶液離子濃度通過自由擴散才能保持一致？假如說在磁力攪拌器攪拌的情況下，3小時透析袋內外離子濃度擴散到一致，透析袋內液體1ml,透析液200ml, ProteinA/G特異性親和純化的過程，用洗脫液（0.1M Gly-HCl，pH2.7）洗脫和中和緩沖液（0.5M Tris-Cl，pH8.0）中和，此時抗體溶液的中甘氨酸和Tris濃度很高，-NH2總濃度達到0.3M左右，我們每次透析稀釋200倍，四次透析后稀釋了1.9*10-4uM,1mg/ml的抗體的濃度為6.67*10-3uM，抗體是-NH2濃度的35倍，這樣的抗體，基本不影響標記。但前提是以上的透析必須充分透徹，有時候我們為了省事，把幾個抗體放在一個透析缸里進行透析，透析就是不充分了。那么我們如何解決這個問題呢，在透析的時候可以試著加一點不會對抗體、HRP和標記過程有影響的示蹤劑，這個示蹤劑的濃度是-NH2總濃度的數倍，這個倍數的確定方法：肉眼可見顏色的示蹤劑最低濃度乘以達到理想離子去除濃度所應該透析的倍數，最后確定示蹤劑加入的濃度。
蛋白類熒光的標記，基本上習慣于利用交聯劑進行間接定向標記的技術路線。最常見的可用于標記的熒光蛋白主要有藻紅蛋白（R-PE）和別藻藍蛋白(APC),還有一個多甲藻黃素-葉綠素-蛋白復合物（PerCP）比較少用。福因德經過數年測試，研發出了藻紅蛋白（R-PE）-抗體標記試劑盒和別藻藍蛋白(APC)-抗體標記試劑盒，可以大大節約科研工作者的標記摸索時間，同時取得比較好的實驗效果。
2.化學小分子標記物（熒光素標記物）的標記；
這類小分子的標記的目標基團還是蛋白或者抗體表面暴露的-NH2，熒光素經過修飾，其衍生物上含有可以與-NH2反應的活性官能團，當然為了適應不同的標記反應需求，可以在熒光素的修飾不同的官能團，以適應與抗體不同的官能團對接偶聯需求。這類小分子的標記的核心是設計出最好的標記策略和標記條件優化，這是兩個難點，福因德經多年的技術摸索，摸索出最優化的標記條件，對于最令人頭疼的摩爾濃度計算的問題，我們開發出在線標記計算小工具，輕松實現計算，再也不會因為計算出錯而影響標記效果了。目前，我們可以提供的熒光素試劑盒有如下種類：Frdbio® 熒光素Cy3, Frdbio® 熒光素Cy5, Frdbio®FITC, Frdbio®熒光素Flour350, Frdbio®熒光素Flour405, Frdbio®熒光素Flour488, Frdbio®熒光素Flour555, Frdbio®熒光素Flour590, Frdbio®熒光素Flour594, Frdbio®熒光素Flour647, Frdbio®熒光素Flour680, Frdbio®熒光素Flour750, Frdbio®熒光素Flour770.
這里要特別說說關于生物素（biotin）的標記，與上述小分子熒光素的標記原理基本相同，生物素標記配合鏈霉親和素作為目前應用最為廣泛的一種免疫學檢測放大手段和工具。福因德研發團隊在傳統的長臂生物素標記試劑基礎上，設計出標記效率最為友好的生物素結構，主要優點：1.標記效率提高3-5倍，2.是標記產物的穩定性更好，3.對抗體或者被標記蛋白結構影響最小。在此技術支持下的超級生物素標記試劑盒，或許能夠解決您的免疫系統林敏度問題。經過生物素標記的抗體或者蛋白產物，究竟其標記效果如何？福因德開發出了相應的配套檢測計算試劑盒(HABA法生物素標記效率檢測試劑盒)，讓實驗者輕松實現標記效果檢測，實驗效果更好，實驗邏輯思路更嚴謹。生物素與鏈霉親和素是一個免疫學實驗經典組合，鑒于生物素和鏈霉親和素強大的結合能力，其可以使免疫學信號放大幾十倍甚至上百倍，由于這套系統超高的靈敏度，所以對于鏈霉親和素酶標記復合物的要求也很高，不但要特異性結合能力強，而且還要非特異性結合最少，鏈霉親和素酶復合物中應用最多的是鏈霉親和素-HRP，除此以外還是有各種熒光素結合復合物，如FITC-鏈霉親和素，Fluor488-鏈霉親和素，等等，需要更多的熒光素標記鏈霉親和素，請聯系我們。
3.酶催化標記
酶催化主要是針對重組蛋白的標記的，最為經典的是在生物素連接酶(Biotin Ligase,BirA)的催化下，對含有AviTag標簽多肽進行特異性標記的，AviTag標簽多肽是一個15個氨基酸的短肽（GLNDIFEAQKIEWHE），標記過程可以在重組蛋白表達的同時進行，也可以后期在宿主體外實驗進行，對重組蛋白進行特異性定點標記，可以方便蛋白通過Streptavidin填料進行特異性純化，這對于解決其他標簽無法純化，效果不佳的問題，提供新的解決方案和途徑。經過生物素標記的蛋白可以更方便用于進行下游的免疫學實驗。關于通過生物標記途徑進行蛋白純化的整體方案，可以與我們技術部門溝通，這套體系包括從載體設計，到蛋白的生物素標記，再到Streptavidin填料純化，以及可能涉及到的蛋白酶切割，我們都可以提供整套解決方案，在此遇到困難的小伙伴可以與我們聯系解決。
4.特異性結合與非特異性結合標記
上文已經提到了一些，特異性結合最經典應用最多的就是生物素-鏈霉親和素（親和素系統），這里有個經典的試劑，SABC試劑，先用生物素標記HRP，讓后將生物素標記的HRP與鏈霉親和素（親和素）按照特定比例混合，一個親和素上有4個生物素結合位點，只要生物素的位點不被生物素不被飽和覆蓋（最好是被生物HRP結合是三個位點），空余一個位點，這樣最利于生物化標記抗體的下游配套試劑使用，生物素標記的抗體的一個生物素位點可以衍生出三個HRP分子，信號瞬間放大3倍以上，比HRP直接標記抗體性能好很多倍，當然這個是理想狀態，實際實驗中需要實現高效能需要不斷的優化摸索。
非特異性標記的經典用途是膠體金標記，這里不做贅述，需要了解相關信息，請關注我們的官方網站，我們將不定期推出非常接地氣的技術方面的原創文章。