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Edman測序的鑒定流程和特點

作者:北京百泰派克生物科技有限公司 2020-09-09T14:41 (訪問量:22002)

Edman測序法是一種用于多肽中氨基酸序列測定的化學方法。該方法由Pehr-Edman于1960年開發。該測序法通過化學反應依次切下蛋白N端的每一個氨基酸,再使用高效液相色譜法分別鑒定氨基酸的ID,多次鑒定出的序列信息即為最終的蛋白質序列。

Edman測序流程

l 假設我們的氨基酸序列是MYKMRYY;

l 用異硫*酸鹽對氨基末端進行標記;

l 水解樣本,將被標記的氨基酸分離出來;

l 使用高效液相色譜法(HPLC)鑒定被標記的氨基酸;

l 然后再次標記剩余多肽鏈中的N端;

l 重復以上循環,直到最后一個氨基酸。

百泰派克蛋白質N端測序圖示流程如下:

Edman測序的優勢

l 不需要對照已有蛋白質序列庫,就能100%保證確定蛋白質序列;

l 對于發生N端突變或者經改造過的蛋白,仍然可以提供直接的序列測定,且更為準確。

Edman測序的局限性

l 通量較低,無法對多個蛋白質進行同時分析;

l 分析過程相對耗時,每個殘基測試大概需要45分鐘,且殘基測序成本高;

l 由于此測序法需要從蛋白質N端開始,對于N端封閉的蛋白質則無法使用該法進行測序;

l 蛋白質樣品量需求較大;

l 一般僅對N端氨基酸序列在50個左右的蛋白樣品進行檢測時,精準度才高,超過數量,準確率和效率都會降低。

針對Edman測序的局限性的解決方法

l 針對通量低的問題,我們可以結合質譜鑒定和Edman測序二者的優缺點,取長補短,實現高通量的蛋白鑒定和序列測定。

l 針對N端封閉的蛋白質,我們可以根據具體情況,選擇相應的酶來去除蛋白N端的修飾,或者使用質譜鑒定法來鑒定N端的修飾。

Edman測序的應用領域

l 可用于蛋白表達產物的驗證。驗證重組蛋白插入位點和表達順序是否正確。

l 可用于驗證細胞株建立和發酵過程中的蛋白產物。驗證細胞株建立和發酵過程中蛋白產物N端甲硫氨酸和信號肽是否正確處理。

l 可用于分析蛋白降解/酶切。對降解/酶切形成的新蛋白片段N端進行分析,確定斷裂/酶切位點。

l 可用于De-novo測序。能夠對蛋白數據庫中不存在的全新蛋白序列進行分析。

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