1. 將待標記的抗體/蛋白(濃度≧1mg/ml)對標記反應液 (90mM NaHCO3,10mM Na2CO3,126mM NaCl,pH9.0) 于4℃透析三次。
2. 將FITC(Frdbio)溶于DMSO中,濃度為20mg/ml。每次交聯使用的FITC均應新鮮配制,避光。
3. (抗體/蛋白質:FITC)=1mg:150μg的比例將FITC緩慢加入于抗體溶液中,邊加邊輕輕晃動使其與抗體混合均勻,避光4℃反應8h。
4. 加入5M的NH4Cl至終濃度50mM,4℃終止反應2h。
5. 將標記產物在PBS中透析4次以上,至透析液清亮。
6. 交聯物的鑒定
蛋白濃度(mg/ml)=[A280–0.31×A495]/1.4
抗體/蛋白質:FITC比例=3.1×A495/(A280–0.31×A495),該值應介于2.5~6.5之間。
7. FITC標記的蛋白應置于pH7.4的磷酸鹽緩沖液中,加入0.1% NaN3、1% BSA,30%甘油,短期保存于4℃避光,長期應該-20℃避光保存。
