由于缺乏有效的基因遞送工具，基因轉(zhuǎn)染在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域受到了限制。最近，脂質(zhì)納米粒 (LNP) 作為在體內(nèi)外均安全有效的核酸輸送載體而引起了人們的興趣。然而，脂質(zhì)納米粒的傳統(tǒng)制備方法面臨著許多挑戰(zhàn)，例如操作人員差異，以及放大困難。在此，我們介紹了一種基于微流控的可放大 NanoAssemblr 平臺(tái)，可重復(fù)、穩(wěn)健地制備質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒。質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒實(shí)現(xiàn)了95%的轉(zhuǎn)染效率，并在體內(nèi)外實(shí)現(xiàn)了外源基因在難以轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元中的高度表達(dá)。
通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒進(jìn)行基因輸送
脂質(zhì)納米粒(LNP) 是一種可用于將核酸遞送至細(xì)胞的平臺(tái)。脂質(zhì)納米粒模擬通過(guò)內(nèi)源性途徑吸收的低密度脂蛋白(LDL)。脂質(zhì)納米顆粒對(duì)pH 值敏感，旨在將其荷載的藥物釋放到細(xì)胞質(zhì)中。
NanoAssemblr 系統(tǒng)
NanoAssemblr 平臺(tái)采用微流控技術(shù)精確控制微升至毫升級(jí)規(guī)模的納米顆粒制備。
大鼠原代神經(jīng)元中的體外GFP 表達(dá)
共聚焦熒光顯微結(jié)果顯示在5 μg/mL ApoE 的情況下，用包封GFP 編碼的質(zhì)粒DNA 的脂質(zhì)納米粒處理后，MAP2 陽(yáng)性神經(jīng)元中的GFP 表達(dá)（綠色）。
大鼠大腦中的體內(nèi)GFP 表達(dá)
顯示對(duì)10月齡FVB小鼠紋狀體注射含GFP編碼質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)納米粒后48小時(shí)GFP表達(dá)（綠色）的腦切片熒光顯微照片。注射5 μl 3 mg/mL GFP質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒制劑。用DAPI（藍(lán)色）染色的細(xì)胞核、DiD（紅色）染色的脂質(zhì)納米粒以及GFP表達(dá)（綠色）共定位于同一張圖片內(nèi)。脂質(zhì)納米粒攝取和GFP表達(dá)兩者共定位于注射部位即紋狀體中，并已擴(kuò)散到周圍其他區(qū)域，包括腦室系統(tǒng)和胼胝體在內(nèi)的多個(gè)部位。
流式細(xì)胞分析顯示 GFP 表達(dá)和顆粒攝取
GFP+神經(jīng)元的百分比表明質(zhì)粒表達(dá)取決于劑量，劑量為0.6 ug/mL時(shí)百分比最高。
對(duì) GFP MFI 也觀察到了同樣的劑量反應(yīng)模式，每次處理 n=3，采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，**** p<0.0001, ** p<0.005。
用包封GFP 編碼質(zhì)粒DNA 的脂質(zhì)納米粒處理過(guò)的DIV 7大鼠原代神經(jīng)元中GFP表達(dá)的流式細(xì)胞分析。在最高劑量(0.6 ug/mL) 下，超過(guò)60% 的神經(jīng)元表達(dá)了GFP。GFP陽(yáng)性百分比和GFP表達(dá)強(qiáng)度（平均熒光強(qiáng)度；MFI）均可通過(guò)GFP質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒的劑量進(jìn)行滴定測(cè)量。在有1 μg/mL ApoE的情況下處理48 小時(shí)后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
DiD+神經(jīng)元的百分比表明脂質(zhì)納米粒攝取取決于劑量，劑量為0.6 ug/mL時(shí)百分比最高。
對(duì) DiD MFI 也觀察到了這樣的劑量反應(yīng)模式，每次處理n=3，采用Dunnett多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，**** p<0.0001，** p<0.005。
對(duì)大鼠原代神經(jīng)元中質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒攝取的流式細(xì)胞分析。在DIV 7用含有質(zhì)粒DNA的脂質(zhì)納米粒和熒光染料DiD對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。質(zhì)粒劑量為0.6 μg/mL時(shí)，超過(guò)95%的神經(jīng)元表現(xiàn)出脂質(zhì)納米粒攝取；在該劑量的十分之一(0.06 μg/mL) 下，攝取率超過(guò)85%。在有1 μg/mL ApoE的情況下處理48 小時(shí)后，進(jìn)行流式細(xì)胞分析。
附加表征
未觀察到脂質(zhì)納米顆粒存在細(xì)胞毒性
Spark和Benchtop的包封率接近 100%
脂質(zhì)納米顆粒粒徑大小不受質(zhì)粒長(zhǎng)度影響
由于樣品切換的緣故，在Benchtop上制備的質(zhì)粒脂質(zhì)納米顆粒粒徑較小。
基于微流控的NanoAssemblr?技術(shù)能夠以可重復(fù)的方式制備質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒，這些顆粒可在體內(nèi)外有效介導(dǎo)原代神經(jīng)元中的基因表達(dá)，表明在NanoAssemblr?平臺(tái)上制備的質(zhì)粒-脂質(zhì)納米粒是神經(jīng)科學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域的有效輸送工具。
在NanoAssemblr 平臺(tái)上制備質(zhì)粒-脂質(zhì)納米顆粒
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