噴墨打印將活細胞自由微圖案化到細胞培養基中-技術前沿-資訊-生物在線

噴墨打印將活細胞自由微圖案化到細胞培養基中

作者：上海睿度光電科技有限公司 2021-08-11T00:00 (訪問量:12320)

 

微制造方法已廣泛用于控制微米級的局部細胞環境。然而，準確地模擬體內的復雜性在同一基質上共培養多種類型的細胞時，在保持形式和設計自由的同時保持組織結構仍然是一個挑戰。噴墨打印是解決這個問題的最佳辦法之一，可以通過直接將活體細胞圖案化打印到細胞友好的液體環境中，是基礎生物學和應用生物技術的強大而通用的工具。

 

微制造方法已廣泛用于控制微米級的局部細胞環境。然而，準確地模擬體內的復雜性在同一基質上共培養多種類型的細胞時，在保持形式和設計自由的同時保持組織結構仍然是一個挑戰。浦項科技大學相關課題組在“Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing”（發表于《Scientific Reports》）的研究中首次提出了一種按需噴墨打印方法，可將活細胞直接圖案化到細胞友好的液體環境中。通過細胞噴射和撞擊行為的高速成像精確優化打印參數，實現細胞位置的高分辨率控制。該課題組通過將不同的細胞共同打印成各種設計，包括復雜的梯度排列，展示了直接細胞打印方法的能力。最后，課題組通過在培養基填充的培養皿中生成以不同大小的棋盤圖案打印的A549和HeLa細胞，應用該技術來研究細胞群的異質性和幾何形狀對季節性H1N1流感病毒 （PR8）感染性的影響。直接噴墨細胞圖案化可以成為基礎生物學和應用生物技術的強大而通用的工具。
 

基于直接噴墨的細胞打印系統和工藝

研究團隊將載有細胞的墨水噴墨打印到充滿細胞培養基的細胞培養皿的預定位置上 （圖 1a）。使用帶有xy移動臺和z軸升降噴頭的壓電噴墨打印系統（Jetlab® II，MicroFab Inc.）制造復雜的細胞圖案。作為墨水，活細胞以6×106個細胞mL-1的密度懸浮在細胞培養基中。在打印之前評估了充滿細胞的墨水的剪切粘度。細胞通過一個直徑為80μm的噴頭 (MJ-ATP-01 80, Microfab Inc.) 從儲墨器中打印出來，并注入一池液體介質中以進行圖案化?；罴毎ㄟ^多個步驟排列在預定的圖案上（圖 1b）。首先，使用施加的壓電信號輸入從噴墨噴頭的尖端噴射載有細胞的液滴。在單次閃光圖像中捕獲液滴形成的階段（圖 1c）。接下來，將排出的細胞放入培養皿中的培養基中（圖 1d）。當液滴與液體介質聚結時形成渦環。渦流在大約1毫秒內迅速傳播到液體中，并隨著速度變慢而變得更寬。初始滲透深度為~167µm，然后細胞以~14.2µm s-1的速度緩慢分散到液體中，直到它們到達培養皿底部（圖 1e）。隨著時間的推移，細胞粘附在印有圖案的培養皿底部。
▲ 圖1   直接噴墨單元打印系統和工藝。（a）使用3軸可控壓電噴墨打印系統進行直接噴墨單元圖案化的裝置示意圖。(b) 在充滿液體的板中對細胞進行圖案化的過程的示意圖。（c）使用 CCD 相機和火花閃光燈以30微秒的間隔獲得充滿細胞的液滴噴射的高速頻閃圖像。( d) 液滴撞擊充滿液體的基材后下沉細胞的高速電影圖像。( e ) 在不同的時間間隔跟蹤下沉細胞的位移。
接下來，研究團隊使用3種不同的檢測方法檢查了細胞活力和增殖：在細胞打印后立即使用LIVE/DEAD檢測試劑盒進行即時測量，跟蹤細胞增殖率1周，以及長期檢查維持培養物中的細胞形態3周。LIVE/DEAD測定的結果顯示打印組和移液對照組之間的即時存活率差異可忽略不計（圖 2a）。打印組和對照組的存活率分別為98.6%和99.0%。一周后，打印組的細胞密切遵循移液對照組的生長曲線，F=0.06485。在雙向方差分析中，組間沒有觀察到顯著差異（p>0.05）（圖 2b））。此外，由于打印細胞的增殖，在第7天觀察到的打印細胞增殖高于對照組。在打印后獲得的細胞圖像中，細胞保持其形態并存活3周，代表8代（圖 2c）。沒有觀察到染色體斷裂或細胞損傷的明顯跡象。

▲ 圖2   印后細胞活力測試。( a ) LIVE/DEAD測定用于測量打印后立即的細胞存活率。( b ) 每隔一天測量增殖率，持續7天。（c）監測長期細胞形態直至第8代。比例尺：50μm。

研究團隊使用直接噴墨打印工藝對NIH3T3和HEK293A細胞的各種設計進行圖案化。首先，圖 3a顯示了印在細胞培養皿上的遷移測定模型，用于跟蹤和量化傷口愈合或藥物反應測定中的細胞行為。NIH3T3細胞以受控密度進行圖案化，留下0.5和1mm的空間。每天捕獲圖像以顯示隨時間推移由細胞增殖和遷移引起的間隙閉合。接下來，NIH3T3細胞用3種不同的熒光染料，紅色、綠色和藍色（RGB）標記，并進行圖案化以證明異型細胞圖案化的可能性（圖 3b-e）。細胞被打印成足夠精細的圖案，以顯示彎曲的設計和不同顏色組的邊緣邊界之間的區別。在驗證使用RGB標記的細胞制造異型共培養模型的可能性后，使用不同的細胞系打印了真正的異型共培養模型（圖 3f）。NIH3T3小鼠成纖維細胞和HEK293A人腎細胞被共同圖案化到具有鋸齒形界面的Dulbecco改良Eagle培養基（DMEM）中。鋸齒形圖案的邊界清晰可見，因為含有NIH3T3細胞的區域似乎比含有HEK293A細胞的區域明顯更暗。
▲ 圖3   直接打印到培養基中的各種細胞圖案的演示。（a）具有1mm和0.5mm間隙的打印細胞遷移測定模型。比例尺：500µm。（b-e）紅色、綠色和藍色標記的細胞圖案的熒光圖像。比例尺：1mm。（f）使用NIH3T3和HEK293A細胞的異型共培養模型打印的鋸齒形圖案。比例尺：1mm。
除了高分辨率圖案外，直接細胞打印的另一個優點是它能夠通過改變液滴密度來引入細胞濃度梯度。研究團隊通過簡單地打印3種RGB標記的細胞墨水來繪制包含7種彩虹色、 青色和洋紅色的9種主要顏色的顏色圖表，以顯示在濃度梯度中對細胞進行圖案化的能力（圖 4a）。根據從所需的9種顏色獲得的預設RGB顏色比率，將細胞圖案化為9個切片方塊。例如，第一行中心的橙色是通過分別以5:2:0的比例打印3個RGB標記的單元格而著色的。這一策略舉例說明了一步控制單個培養皿中的細胞密度和圖案。在僅使用3個彩色單元格驗證了雜色表達之后，研究團隊嘗試模仿Georges Seura的杰作“埃菲爾鐵塔”。他們在介質中打印了RGB標記的細胞，通過使用并列的微小彩色點來對繪畫進行圖案化，類似于這位法國后印象派畫家使用的方法（圖 4b）。細胞密度梯度的有效控制和其噴墨打印方法的高分辨率在“埃菲爾鐵塔”打印中創造了一個漸進和連續的細胞分類。對細胞密度的局部控制使我們能夠在類似的印象中可視化和模仿原始特征。
 
▲ 圖4   使用直接噴墨細胞打印的密度控制2D單元格圖案。( a ) 九色圖表打印有用紅色、綠色、藍色 (RGB) 染料標記的單元格。比例尺：1mm。( b ) Georges Seurat 的“埃菲爾鐵塔”用標記有3種顏色染料的細胞進行了圖案化。比例尺：1mm。
這里開發的直接打印方法在液體環境中生成了多種類型細胞的自由形式圖案?；罴毎氖芸乜臻g位置是通過將懸浮在小瓶中的活細胞通過按需噴墨噴頭輸送到培養基填充的培養皿中而創建的，而不會引起損壞。這種方法可能為更準確地模擬在活生物體中觀察到的關鍵細胞 - 細胞和組織 - 組織界面提供新的機會。此外，該技術可應用于高通量分析和藥物篩選。

參考文獻：

[1] Park J A ,   Yoon S ,   Kwon J , et al. Freeform micropatterning of living cells into cell culture medium using direct inkjet printing[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1):1669.

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