His tag堪稱純化標簽一哥，我想沒有人會站出來反對。做蛋白親和純化的人就沒有沒聽過His名號的。

我們稀里糊涂跟它打交道了很多年，有天突然就想一個問題：

這貨當初是怎么來的？

是誰發明了它？

時代的呼喚！?。?/span>

在上世紀70年代，蛋白質的分離和純化技術相對有限，需要新的方法來提高分離效率和純度。

01

His tag用于蛋白純化的思想啟蒙

1975年, J. Porath等人的研究論文中，實驗者將金屬螯合親和層析（Metal chelate affinity chromatography, 簡稱MCAC）技術應用于蛋白分離【1】。研究者首先將金屬離子（如Cu²⁺、Ni²⁺等）固定到IDA-衍生的凝膠上，形成金屬螯合親和層析介質。利用這種介質，研究者進行了蛋白質的吸附實驗，探究不同蛋白質與金屬離子的親和性。實驗發現，某些蛋白質可以特異性地結合到固定化的金屬離子上，而其他蛋白質則沒有這種結合能力。通過改變溶液的pH值或使用競爭性配體，可以有效地從親和層析介質上洗脫結合的蛋白質。

這項技術利用了蛋白質上的某些氨基酸殘基（如組氨酸、半胱氨酸、賴氨酸等）與金屬離子（如鎳、銅、鋅等）的親和作用，通過這些金屬離子固定在帶有亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid, IDA）或其他配體的樹脂上，實現對蛋白質的親和層析。

這項研究成果的發表標志著親和層析技術在蛋白質分離領域的應用邁出了重要的一步。它不僅為后來的研究人員提供了一種新的蛋白純化實驗方法，而且為理解蛋白質結構和功能提供了新的視角。

02

His tag的雛形

1988年，Smith等人提出了在蛋白質N-末端添加特定的金屬螯合肽（Chelating Peptide, CP），以增強其與固定金屬離子的結合能力，從而提高純化效率。這種方法被稱為CP-IMAC，它通過在目標蛋白質上引入一個CP序列，使得蛋白質能夠通過IMAC被特異性地純化【2】。

實驗人員設計了螯合肽His-Trp與促黃體激素釋放激素（LHRH）類似物2-10 LHRH的N-末端融合表達,結果融合蛋白可以與Ni²⁺形成配位復合物并具有高親和性。此外，實驗人員設計了His-Trp-胰島素原作為重組CP-蛋白質模型，利用該模型研究了其在大腸桿菌中表達，研究其與固定化Ni²⁺的結合和洗脫情況。

03

His tag的發展

1989年，瑞典斯德哥爾摩皇家理工學院生物化學與生物技術系Ljungquist C等人也利用基因融合方法，將目標蛋白的基因與編碼親和肽段Ala-His-Gly-His-Arg-Pro的基因片段融合，為了使表達的融合蛋白可以與固定化金屬離子（Zn²⁺）結合而利用親和色譜法（IMAC）進行純化，研究者合成了編碼親和肽段的連接體，以上述編碼親和肽段為基本單位，分別做兩次，四次串聯聚合，這樣制備出分別含有2個、4個和8個His氨基酸的親和肽段，然后將這肽段與編碼雙結構域蛋白A分子ZZ的基因的3'端和編碼β-半乳糖苷酶的基因的5'端融合。研究發現，不含有或兩個His的親和肽段的融合蛋白與固定化Zn²⁺的結合能力較弱，而含有4個或8個His的親和肽段的融合蛋白則顯示出較強的結合作用。通過pH梯度改變，發現ZZ融合蛋白可以根據親和肽His的數量多少在不同的pH值下從樹脂上洗脫，His數越多，結合力越強，洗脫的pH值越低【3】。

His-Gly-His 這樣的結構，可對Co2+,Ni2+ 和 Cu2+有高親和力，但是我們發現實驗人員緊隨其后連接一個Arg，其目的是為了增加正電荷，該標簽不但可以用于親和層析，還能用于離子交換純化。隨著親和肽重復數的增加，其pI（Isoelectric point,蛋白質等電點）值不斷升高，這與Arg有關，精氨酸的設計就是為了調節pI；研究人員緊隨其后還加了一個Pro,原來胰蛋白酶樣蛋白酶在哺乳動物、人和細菌中都廣泛存在，偏好切割堿性氨基酸后面的肽鍵，如果在堿性氨基酸后面緊接著一個Pro，則可以大大減少該酶對肽鍵的降解。

另外，研究人員還發現，如果親和肽標簽放在N-端，β-galactosidase局有完全酶活性，但如果放在c-端其活性將大大降低。這就提示我們，標簽位置很重要。

這是1989年的一篇文獻，足以看出本文作者扎實的生化專業功底。讀完這篇文獻，我們再利用His標簽進行蛋白純化的時候，不應該只會簡單利用現有質粒載體上的6XHis了，更不應該遇到6XHis標簽純化不下來的蛋白，直接粗暴加長到8XHis，甚至12xHis；不但如此，我們還要牢記標簽的位置很重要，雖然說放在目標蛋白的N-端或者C-端都可以，甚至是蛋白結構凸起的序列內，標簽位置對后續的純化影響很大，對蛋白活性影響更大。

至于這篇文章中為什么用Zn²⁺,而不是用Ni²⁺,我還沒有找到答案，可能是Zn²⁺結合力弱于Ni²⁺，洗脫條件會更溫和一些，利于保護蛋白質活性。

這篇1989年的文章信息量之大，含金量之高，時至今日，仍具有很大的參考價值。

04

6XHis tag的確立

說到這里，我們還有一個問題，為啥那些商業化載體上大部分是6XHis標簽，這個“6”是怎么來的？

1988年，Hochuli等人以小鼠二氫葉酸還原酶(Dihydrofolate reductase, DHFR)為演示蛋白分別在其N-端和C-端融合2-6個His，然后將這系列蛋白在大腸桿菌里表達，通過Ni²⁺-NTA親和純化研究。研究結果表明，只有當His個數達到6的時候，重組蛋白在6M GuHCl的溶液里,才能達到90%以上的結合效果。也就是說6XHis tag可以在大多數相對極端環境（比如鹽酸胍）下保證重組蛋白與Ni²⁺-NTA親和填料的最佳結合效果【4】。當然，在PBS溶液中，2-4個His標簽都會有很好的結合率；實驗數據還表明，相同數量的His標簽，在N-端和C-端，其結合效果還是很有差異的，上文我們也提到了，His標簽放在不同的位置，不但會影響其活性還會影響其與Ni²⁺-NTA的結合效率。

05

His tag的位置問題

His tag通常被設計融合在目標蛋白的N-端或C-端，目標蛋白與His tag之間還設計一段短的柔性多肽連接，這個短肽間可包括一個蛋白酶的切割位點（比如，TEV酶，腸激酶EK，等）。很少將標簽設計在蛋白序列的內部，偶爾也有設計在蛋白突出的環凸中。His標簽的位置需要基于蛋白的特性考慮，有時可能需要設計多個不同標簽位置的構建體進行測試，從中優選。 盡管實驗人員普遍認為His tag比較小，不會影響蛋白的特性，但是文獻數據和我們的實驗案例證據都顯示，His-tag的添加對很多蛋白都有負面的影響，比如改變蛋白的聚集狀態，改變等電點，改變抗原的免疫原性和反應原性，影響蛋白質的酶活性，影響溶解度等等。

06

用于His tag融合蛋白純化的固相組成

所謂固相組成就是我們常說的純化填料，包括固相基質、螯合劑和金屬離子。

市場上最常見的固相基質主要有交聯瓊脂糖（sepharose）、交聯葡聚糖（sephadex）、大孔硅膠及一些有機聚合物等，近些年，磁珠也很流行。

至于螯合劑，亞氨基二乙酸 (iminodiacetic acid，IDA) 和氮三乙酸 (nitrilotriacetic acid，NTA) 的衍生物最常用，除此之外，還有N,N,N-三（羧甲基）乙烯二胺（TED）、四乙烯戊胺（TEPA）、羧甲基α,β-二胺丁二酸（CM-DASA）和乙二胺N,N-二乙酸（EDDA）等。

常用的金屬離子有：二價陽離子 Cu²⁺、Ni²⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等過渡金屬離子。金屬離子與螯合劑作用時，一般形成五元環或六元環，結構更穩定，且環數目越多結構越穩定。

那么多金屬離子，為啥Ni2+受偏寵？

金屬陽離子的選擇通常是結合能力和純度之間的折衷。Ni²⁺比較中庸，因為它在這些因素之間提供了最好的平衡，而Co²⁺對His tag結合能力稍低，對內源性蛋白質的親和力也較低，常常用于高純度蛋白的提取純化。

07

His tag融合蛋白洗脫方法

利用His tag純化蛋白，從固相載體洗脫His tag融合蛋白，最常用的有三種方法，常常將這三種方法組合使用。為了避免蛋白質變性和功能失活，盡可能選用溫和的方法。

1.類似物競爭洗脫

為了使His-tag 融合蛋白從載體上釋放，可以使用一種與 His-tag類似結構的化合物，該化合物也與固相載體上的金屬離子形成配位復合物，將His-tag融合蛋白從固相載體上競爭下來，咪唑是組氨酸的側鏈，也就是我們在做His tag融合蛋白純化最為熟悉的洗脫試劑，通常以150 - 500 mM 的濃度用于洗脫，也可以使用組氨酸或組胺。

2.pH值降低

當 pH 值降低時，His殘基被質子化，不再能與金屬離子配位，從而使蛋白質被洗脫。當使用Ni²⁺作為金屬離子時，它在 pH 值 4 左右洗脫，而Co²⁺在 pH 值 6左右洗脫。隨著His個數增多，其洗脫的pH也越低。

3.金屬離子螯合去除

強螯合劑（如 EDTA）可以直接螯合”搶走”通過螯合劑固定在固相載體上的金屬離子，因此蛋白質會從固相載體上脫離。目前，有些商業化公司已經開發出可以耐受EDTA的填料。

以上三種洗脫方法，第一種最溫和，是目前最常用的標準洗脫方法，當然，洗脫劑不僅限于我們耳熟能詳的咪唑，還可以用組氨酸或者組胺；第二種最生猛，低pH溶液強酸溶液環境會對蛋白造成不可逆的損傷；第三種屬于殺雞取卵，強行將金屬離子從固相載體上剝脫下來，這個填料就廢了，不能再次使用，如果想要再次重復使用這個填料，需要重新加金屬離子，也就是所謂的重生，再次重生的填料在效果上肯定不如原裝出廠的純化效果好。

08

His tag用于重組蛋白純化

His tag非常廣泛地應用于重組蛋白表達純化，可以說是蛋白純化領域最亮的崽。

目前，很多商業公司研發出His tag融合重組蛋白表達純化系統的系列產品，從重組蛋白表達載體構建到純化填料，以及該系列產品的標準化操作流程，都有保姆級的使用教程和非常完善的指導體系。

但是，這些流程只對初學者掃盲有用，真正的有經驗的蛋白純化人員不應僅僅拘泥于此。一分鐘學會的如此簡單His tag重組蛋白純化技術，遇到的問題大抵是讓你一年欲哭無淚，愛而不得：明明看到蛋白表達，卻是純不下來，或者純下來的雜蛋白比目標蛋白還多，喧賓奪主。

這些商業化的表達載體上的蛋白表達單元框內一般會設計連續的6個His(6xHis)在N-端或者C-端，或者兩端都有；當我們將目標蛋白基因通過多克隆位點（Multiple Cloning Site, MCS）插入達到表達載體的時候，可以構建出N-端、C-端或者兩端都帶6xHis標簽的融合蛋白。

基因合成技術如此發達的今天，誰還過度依賴于載體上那幾個His標簽的有無和位置，目標基因的插入誰還拘泥于多克隆位點的那幾個限制酶切位點憋屈，誰還局限于那老套的6XHis？

在此基礎上，研究人員設計出各種His tag的衍生玩法。

HQ tag

HQ tag標簽的序列是HQHQHQ，是在6XHis tag的基礎上間隔著將氨基酸His改編為Gln, Becky Godat,等人在2008年的《 Affinity Chromatography_ Methods and Protocols》這本書的一個章節里描述了這個標簽，書中沒有明確指出它比6XHis tag優勢之處，但如果非要找出其優勢點：分子量更小，在更低的咪唑濃度(50mM)濃度下可以洗脫HQ tag融合目標蛋白，低濃度的咪唑對蛋白更友好（高濃度的咪唑更容易使蛋白質聚集），也更利于目標蛋白的下游實驗，特別是酶活實驗【5】。

攜帶HQ tag的商業化載體Flexi® Vectors出自promega這個公司，百度搜索關鍵詞“HQ tag”，搜索結果第一條就是promega公司的Flexi® Vectors信息。

6XHN tag

6X HN標簽（HN tag）是His與Asn形成小單元（HN）連續重復6次,即（HN）₆，它與6XHis標簽相比，其與金屬離子結合力更強一些，關于這個標簽的文獻相對較少。

Clontech(Takarabio)公司研發出pET6xHN Expression Vector產品，并申請了相關專利，專利號US7176298。

HAT tag

HAT tag是一種新型陽離子親和標簽，源自雞乳酸脫氫酶，氨基酸序列為KDHLIHNVHKEEHAHAHNK，它包含六個His，與其他氨基酸殘基不均勻交錯分布。HAT tag與 His tag相比,它是一種無電荷分布偏差的可溶性蛋白質，因此，HAT tag融合蛋白具有更好的溶解性。不但如此，HAT tag中His的不均勻交錯排列使其具有更高的可及性，能更有效與固定化的金屬離子結合。HAT tag融合蛋白可以在中性pH下與固定化的金屬離子結合吸附，此中性溶液環境下，細胞裂解物中存在的堿性蛋白酶活性較低，利于大多數蛋白質穩定和活性保持。

HAT被Clontech(Takarabio)注冊了商標，其公司也開發出HAT蛋白表達及純化系統系列產品，又是保姆級教程【6】。

【小結】

His tag用于純化的前景展望

重組蛋白純化就像黑夜，目前已經發現或者發明的標簽充其量也只是夜空里的星星而已，還有更多的未知需要我們去摸索。使用商業化的系統進行蛋白表達純化，我們可能只知道6X His標簽，甚至8X His標簽，對應的純化填料也就只知道Ni²⁺親和樹脂，至于標簽的融合位置，我們往往也只考慮融合在目標蛋白的N-端或者C-端，或者兩端都融合。其實，His tag不僅僅局限于6X His tag，8X His tag，HQ tag，HN tag，HAT tag，你還可以根據目標自身的特征自由發揮，為其量身定制。自由設計His tag你不但需要考慮其融合位置，還要全方位考慮其電荷性，親水性，可及性，酶切位點，水解穩定性等等因素，所有的小心翼翼，都是為了給目標蛋白的純化過程一個更易獲取的方案、給蛋白一個更舒適的環境?；蚝铣杉夹g如此發達的今天，你所設計的序列將不受限于目前這些商業化載體的所謂多克隆位點和現有標簽的框框，一言不合就全基因合成。

至于商業化的配套的純化產品，最常用的就是Ni²⁺填料，次常用的還有上文提及的Co²⁺和Cu²⁺。保姆級教程中，洗脫液中最常用的還是咪唑，其實，洗脫劑不僅限于咪唑，組胺衍生物都應該可以，比如組氨酸和組胺。關于純化填料樹脂，我不太了解，在此不敢多言。

His tag在蛋白純化領域的應用，其序列和結構形式上的設計遠遠不止于上述所提及的這些。七八十年發明這個標簽的幾篇最原始的文獻，已經告訴了我們His tag最底層的邏輯，只是隨著技術的發展，勤快的商業化公司制造出一些比較好用的懶人工具，讓大部分人只知道6 X His和Ni²⁺樹脂填料。

未來利用His tag進行蛋白純化，肯定需要考慮比上述所提及的更多因素，而考慮這些因素僅僅靠人工數著氨基酸去琢磨肯定不行，必然需要借助于計算機設計出最佳的His標簽。

在應用領域上，His tag不僅限于蛋白純化，還可用于熒光標記示蹤，Pull down實驗和免疫檢測等。選擇合適的螯合劑與熒光素偶聯，只需要在目標蛋白上設計合適的His tag，就可以實現對目標蛋白的示蹤定位。Pull down實驗其實跟His tag蛋白純化原理差不多。至于免疫檢測，除了目標蛋白融合上合適的His tag外，還需要特異性的抗體配合，目前，針對His tag，HN tag，HAT tag，市面上都有物美價廉的商業化產品。

一個男人成功的背后，一定站著深明大義的女人。

His tag 的輝煌，同樣離不開二價陽離子們的默默付出。His tag 與 Ni²⁺ 的關系，就如同天作之合，雖然偶爾也會與 Co²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺ 等其他陽離子搞個曖昧，但這些都無法與 Ni²⁺之間的深厚情誼相提并論。像這樣的神仙眷侶還有很多，比如：蛋白酶與蛋白酶抑制劑，凝集素與糖蛋白，受體與配體，酶與底物，當然不能少了最耀眼的生物素與親和素。

標簽故事諸多，后續笑談中