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癲癇（Epilepsy）是一種慢性中樞神經系統疾病，影響到全球大約5000萬人。癲癇發作是由于大腦神經元突發性異常同步化放電，導致正常腦功能中斷，臨床表癥為反復不自主發作，身體某一部位或整個身體短暫非自主性抽搐，有時伴有意識喪失和尿便失禁。

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目前，臨床上多采用抗癲癇藥物控制癲癇發作，然而有近1/3的癲癇患者癥狀難以被抗癲癇藥物控制，且藥物難治率在以海馬、杏仁核等區域起源的顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）中甚至可達70%。TLE發作機制復雜，近年來，越來越多的觀點認為癲癇發作是關鍵腦區的功能異常導致神經環路水平上“興奮-抑制”失衡的結果，因此解析TLE中精準環路機制對治療癲癇至關重要。

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2022年8月25日，浙江中醫藥大學陳忠教授團隊在Nature Communications雜志在線發表了題為“Discrete Subicular Circuits Control Generalization of Hippocampal Seizures”的研究論文，研究首次揭示了海馬下托（Subiculum, Sub）存在結構和功能異質性的神經亞群，Sub深層谷氨酸能神經元投射到丘腦前核（anterior nucleus of thalamus, ANT）的神經環路參與TLE發展，其通過SUB-ANT中超極化激活的陽離子門控通道（HCN）介導的簇狀放電增強了TLE的形成和泛化。該研究找到了一條特異性介導顳葉癲癇發作的神經環路，為臨床精準治療癲癇發作及其干預分子靶點提供了強有力的實驗依據。

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結果

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01 Sub錐體神經元雙向調控海馬癲癇發作

首先，研究者借助鈣離子成像技術觀察海馬癲癇發作時錐體神經元的功能變化，將AAV- CaMKIIα-Gcamp6s病毒注射于海馬下托（Subiculum, Sub），并埋入光纖。發現在局灶性癲癇發作（focal seizure, FS）和繼發全身性癲癇發作（Secondary generalized seizure, sGS）期間海馬下托錐體神經元活動增加（圖1a-c）。c-Fos結果顯示，大部分被激活的神經元為谷氨酸能神經元，且激活的模式存在下托亞區特異性，主要集中在下托的深層（圖1f,g）。

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隨后，研究者將AAV-CaMKIIα-hChR2-EYFP和AAV-CaMKIIα-ArchT-EGFP分別注射于WT小鼠海馬下托區（圖1h），在電點燃癲癇發作模型中，光遺傳激活下托錐體神經元促進了癲癇行為發作等級、延長后放電時程（after-discharge durations, ADD）并減少了到達sGS所需電刺激次數；抑制下托錐體神經元則減弱癲癇發作并縮短ADD，且增加了達到FS和sGS所需的電刺激次數（圖1i-k）。提示了下托錐體神經元對海馬癲癇發作具有雙向調控作用。

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圖1 Sub錐體神經元雙向調控海馬癲癇發作

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02 SUB-ANT谷氨酸能投射環路雙向調控顳葉癲癇發作

進一步，借助病毒載體示蹤技術及c-Fos染色發現，下托的谷氨酸神經元向丘腦前核（anterior nucleus of thalamus, ANT）投射，為驗證該通路在海馬癲癇發作過程中的作用，研究者在小鼠SUB區注射AAV-CaMKIIα-hChR2-EYFP，并在ANT埋入光纖（圖2a）。發現光遺傳激活SUB-ANT投射通路可促進海馬癲癇發作等級并延長完全點燃狀態下sGS的后放電時程和總時長（圖2b-f）。此外，借助光遺傳學抑制SUB-ANT投射通路可延緩海馬癲癇發作等級，縮短sGS的ADD和全面性發作時長（GSD）（圖2i-n），這些結果提示了，海馬下托的谷氨酸神經元向丘腦前核的投射通路雙向調控顳葉癲癇的發作。

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圖2 Sub谷氨酸神經元向ANT的投射通路雙向調控顳葉癲癇發作

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03 SUB-ANT和SUB-EC環路對海馬癲癇發作產生相反的作用

研究者繼續對Sub其他下游投射區域（EC：entorhinal cortex 內嗅皮層, NAc：nucleus accumbens 伏隔核, MMB：mammillary bodies 乳頭體）進行研究，借助光遺傳學技術發現，抑制SUB-EC投射通路時可促進海馬癲癇發作（圖3）。

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圖3 SUB-EC、SUB-MMB和SUB-NAc環路在癲癇發作中發揮不同的作用

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接下來，研究者通過向WT小鼠海馬CA1注射海人酸（Kainic acid, KA）誘導慢性自發顳葉癲癇模型做進一步驗證，作者將AAV-CaMKIIα-hM4Di-mcherry注射小鼠海馬下托，并在ANT或EC埋入套管以精準給予CNO藥物（圖4a,b）。發現借助化學遺傳學抑制Sub-ANT通路可緩解癲癇發作；而抑制Sub-EC通路則促進癲癇發作。

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圖4 SUB-ANT和SUB-EC環路在KA誘導慢性TLE發作中產生相反的作用

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基于上述結果，研究者借助逆標染料標記發現Sub深層的谷氨酸能神經元投射到ANT；Sub淺層的谷氨酸能神經元投射到EC（圖5a-d）。隨后，通過特異在谷氨酸能神經元軸突末端表達GCaMP6元件發現，在FSs和sGSs期間，Sub-ANT的鈣信號強度增加；Sub-EC的鈣信號熒光強度減弱（sGSs期間先短暫增加后降低），提示了海馬下托兩個不同的錐體神經元亞群通過不同的投射模式對海馬癲癇發作發揮相反的作用（圖5e-n）。

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圖5 SUB-ANT和SUB-EC環路對海馬癲癇發作產生相反的作用

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04 SUB-ANT中HCN通過調控突觸可塑性促進海馬癲癇發作

通過電生理記錄發現，投射到ANT的Sub谷氨酸能神經元存在超極化激活環核苷酸門控陽離子（hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation, HCN）通道功能和更強的神經元簇狀放電能力，阻斷HCN通道在點燃模型中可顯著緩解癲癇發作等級（圖6a,b）。

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HCN1亞型是嚙齒類動物下托中表達最豐富的一種HCN通道亞型，因此作者研究了選擇性敲除投射到ANT或EC的Sub錐體神經元中HCN1是否會影響神經元放電及海馬癲癇發作，將Cav2-Cre注射到WT小鼠ANT或EC中，AAV-EF1α-DIO-miR30shRNA(Hcn1)-mCherry注射到Sub區（圖6c），發現在海馬電點燃癲癇發作模型中，選擇性下調Sub-ANT神經元中HCN1的表達可緩解癲癇發作（圖6）。進一步研究發現，SUB-ANT中HCN通道通過調控突觸可塑性促進海馬癲癇發生。這些結果提示了SUB-ANT存在HCN通道促進的簇狀放電能力，從而增強了顳葉癲癇的形成和泛化。

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圖6 SUB-ANT中HCN通道通過調控突觸可塑性促進海馬癲癇發生

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結論

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本文利用經典的小鼠顳葉癲癇模型，配合鈣離子成像、光遺傳技術、化學遺傳學技術、病毒示蹤技術、電生理記錄等多種技術手段首次證明了海馬下托存在結構和功能異質性的神經亞群，不同亞區的神經元通過不同的投射下游對顳葉癲癇中的“興奮-抑制”平衡調控產生差異化（甚至相反）的作用，其中Sub深層谷氨酸能神經元投射到ANT的神經環路參與海馬癲癇發作，進一步研究發現SUB-ANT中HCN介導的簇狀放電增強了癲癇的形成和泛化。該研究找到了一條特異性介導顳葉癲癇發作的神經環路，為臨床精準治療癲癇發作及其干預分子靶點提供了強有力的實驗依據。

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該研究的第一作者為浙江中醫藥大學藥學院博士后費凡，浙江大學的碩士研究生王霞及浙江中醫藥大學中醫藥科學院的徐層林研究員為共同第一作者。陳忠教授、汪儀研究員和徐層林研究員為本文的共同通訊作者。研究受到了國家自然科學基金重點項目、國家自然科學基金優青項目、浙江省自然科學基金重大項目等的資助。

和元生物有幸為研究者提供實驗中使用的AAV載體，助力神經科學研究！